Введение в воздушную пугу

Для опыта отбирают 1-дневные эмбрионы. Перед работой яйца просматривают, карандашом отмечают границы воздушной пуги, делают отверстие в скорлупе над воздушным мешком и на мембрану яйца вводят 0,04 мл испытуемого раствора. Отверстие заклеивают. Эмбрионы помещают в термостат при 37°С и 52% относительной влажности.

Введение в хориоаллантоисную оболочку. 0,2 мл испытуемой жидкости вводят в хориоаллантоисную оболочку 3 дневного эмбриона через отверстие, которое делают надвоздушной пугой. Наблюдение за подопытными эмбрионами ведут 2 раза в сутки, в течение 21 суток. Биологическое воздействие токсина определяют по времени гибели эмбрионов и патологоанато-мическим изменениям.

Токсические экстракты кормов, зараженных грибами рода Fusarium, вызывают гибель эмбрионов через 18-25 часов, слаботоксичные - через 30-90 часов. Кровеносные сосуды на хориоаллантоисной оболочке при этом спавшиеся, зародыш гиперемирован (особенно головка и крылья), печень - мраморная, почки - кровенаполнены. На сердечной сорочке кровоизлияния.

При воздействии токсинов гриба рода As-pergillus на хориоаллантоисной оболочке отмечают гиперемию, кровоизлияния, внутренние органы дряблые.

Введение афлатоксинов в желток и воздушную пугу вызывает задержку роста и развития зародыша. Гибель эмбрионов наступает на 5-10 сутки. Если эмбрионы выживают дольше, то зародыш обычно не вылупливается. На вскрытии обнаруживают отек, кровоизлияния, недоразвитие мозга, дистрофические изменения в печени. Отмечается также недоразвитие клюва, укорочение ног, перьевой покров уплотнен.

Определение токсичности на культуре тканей. Доказана чувствительность к микотоксинам культуры клеток: печени куриных эмбрионов; печени, легких и почек крысят; почек теленка и обезьяны; печени эмбрионов человека; фибробластов кожи человека, клеток Хела и др.

Монослойные трипсипизированные

культуры клеток получают обычным способом.

Токсическое действие афлатоксинов на культуры клеток разных типов проявляется характерными морфологическими изменениями: разрушением клеточных органоидов, в том числе

лизосом, изменением ядерно-плазменного соотношения, снижением интенсивности митотическо-го деления, нарушением функциональной активности клеток. Установлено, что афлатоксин В в концентра­ции 0,05 мкг/мл полностью подавляет рост клеток легкого эмбриона человека. ЛД₅₀ для клеток Хела - от 5 до 7 мкг/мл, для клеток печени человека - 14,3 мкг/л.

Культуры клеток почечного эпителия теленка и перевиваемые клетки почек поросенка проявляют высокую чувствительность к токсинам грибов рода Fusarium. Даже в разведении 1-10"⁵ токсинов и экстрактов из зараженного зерна отмечалось изменение размера ядер и снижение активности митотического деления.

К токсинам грибов рода Aspergillusчувствительны клетки Хела, фибробласты эмбрионов человека.

Пеницилловая кислота в концентрации 10 мкг/мл стимулирует митотическую активность клеток Хела.

Патулин в дозах 0,5-1 мкг/мл вызывал увеличение числа патологических митозов на клетках Хел-2.

Определение токсичности на эритроцитах крыс. Исследованиями некоторых авторов было показано, что микотоксины вызывают гемолитическое действие при контакте с эритроцитами крыс. Доказано гемолитическое действие очищенных препаратов афлатоксина, охратоксина, зеараленона, Т-2 токсина.

Определение токсичности на микро­организмах.

Микробиологический метод основан на принципе непосредственного действия экстрактов на чувствительные к данному токсину бактериальные и дрожжевые клетки. О количестве токсина судят по зоне задержки роста тест-культуры. Чувстви­тельность метода - до 0,03 мкг/мл.

Для качественного определения обычно используют метод бумажных дисков, лунок, цилиндров, штрихов. Для количественного определения - метод серийных разведений.

Определение токсичности на растениях и водорослях. Большинство изученных в настоящее время микотоксинов: афлатоксин В,, патулин, пеницилловая кислота, рубратоксин, цитринин, трихотецены обладают выраженной фитотокси- ческой активностью.

Высокую чувствительность к дендродохину, фузариотоксину, стахиботриотоксину и др. проявляют проростки кукурузы, фасоли, кресс салата, пшеницы, овса и др.

Однако более удачным тест-объектомоказались водоросли Chlorellavulgaris. Метод широко апробирован при выделении патулина, роридина А, веррукарина А, пеницилловой кислоты, цитринина и др. Хлорелла, как тест-объект, обладает широким спектром чувствительности. Предложенные биологические методы обнаружения микотоксинов в кормах и продуктах питания с помощью этого метода по своей чувствительности соответствуют, а иногда и превышают необходимую чувствительность по МДУ.

Принято считать, что биологические методы обнаружения микотоксинов в кормах и продуктах питания более трудоемкие по сравнению с физико-химическими и более длительные. Однако, они являются обязательными для подтверждения наличия микотоксинов в исследуемых образцах.

Скрининг методы отличаются относи­тельной простотой и дают возможность быстро и надежно исключать отрицательные образцы. Наиболее перспективны в этом варианте методы мультидетекиии микотоксинов, т. е определения группы микотоксинов.

Количественное определение микотоксинов осуществляется обычно путем выявления интенсивности флуоресценции на пластинках в ультрафиолетовом свете, детекции способом жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектором или флуоресцентным детектором, масс-спектрометром. Для подтверждения наличия того или иного микотоксина на пластинках проводится их обработка различными химическими проявителями.