Система теплообмена, пеногашения и стерилизации ферментационных процессов

Важным классификационным принципом биореакторов различного типа являются системы перемешивания. По способу перемешивания и аэрации биореакторы подразделяются на аппараты с механическим, пневматическим и циркуляционным перемешиванием. Наиболее распространенные конструкции в современной микробиологической промышленности - аппараты с механическим перемешиванием. Такие реакторы имеют механическую мешалку с центральным валом и лопастями (лопатками), число которых обычно равно 6, реже 8. Лопасти могут быть прямыми или изогнутыми, часто их располагают в несколько ярусов, что обеспечивает более эффективное перемешивание больших объемов жидкости. В систему входят также отражательные перегородки - узкие металлические пластинки, прикрепленные к внутренним стенкам биореактора. Они предотвращают возникновение водоворотов и обеспечивают вихревое движение жидкости, равномерно распределяемое по всему объему реактора. Аэрация может осуществляться также путем барботажа – подачи воздуха снизу через горизонтальную трубку с отверстиями, иногда аэрирование достигается применением специальных вибраторов, которые обеспечивают высокую степень асептики, малый расход энергии и относительно слабо травмируют клетки. В аппаратах с пневматическим перемешиванием мешалка отсутствует, и перемешивание жидкости осуществляется пузырьками газа. Естественно, что скорость массообмена в них намного ниже, чем в ферментерах с механическим перемешиванием. Биореакторы с пневматическим перемешиванием характеризуются более мягким (плавным) перемешиванием содержимого и получили распространение при выращивании клеток животных и растений. Биореакторы циркуляционного типа оснащены насосами и эжекторами, создающими направленный ток жидкости по замкнутому контуру (кругу). Жидкость увлекает за собой пузырьки газа и тем самым культуральная среда одновременно с перемешиванием может насыщаться либо атмосферным кислородом, либо (с использованием специальных устройств и эжекторов) газом иного типа. Эти биореакторы отличаются простотой конструкции и надежностью в эксплуатации. В последнее время разрабатываются новые способы аэрации. Например, воздух может подаваться через специальные полипропиленовые мембраны. Это позволяет избегать пенообразования. Теплообмен в биореакторах осуществляется с помощью труб с охлаждающим или нагревающим агентом, которые оплетают аппарат и образуют так называемую рубашку реактора. Иногда эта система труб располагается непосредственно в полости ферментера. Нагревающими агентами в промышленных биореакторах служат горячая вода или пар, в лабораторных ферментерах чаще используется электрический подогрев. Система пеногашениябиореактора – это средство борьбы с избыточным пенообразованием. Существуют химические, механические, акустические и другие виды пеногашения. Наиболее часто применяют химические и механические способы. К химическим средствам пеногашения относятся поверхностно активные вещества, которые, внедряясь в стенки пузырей, становятся центрами их неустойчивости. Эффективными пеногаситслями служат растительные масла и животные жиры. Недостатком этих пеногасителей является то, что при их утилизации микробными клетками сами по себе способствуют пенообразованию. Механические пеногасители представляют собой различные устройства, сбивающие пену: диски, лопасти, барабаны, располагающиеся в верхней части реактора. Более сложными приспособлениями являются сепараторы пены, которые одновременно служат для сбора биомассы, содержащейся в пенном слое. Устройства и режим стерилизации определяется конструкцией биореактора, вспомогательного оборудования, используемых питательных сред и т. п. Наибольшее значение имеют термический метод стерилизации оборудования и сред и фильтрационный способ, применяемый для удаления микроорганизмов из подаваемогов ферментеры воздуха или другого газа.

22. Специализированные ферментационные процессы (анаэробные, твердофазные, газофазные). Газофазная ферментация, в которой процесс протекает на твердом носителе, где закрепляются микроорганизмы, но сами частицы носителя взвешены в потоке газа, насыщенном аэрозолем питательной среды. Твердофазные процессы (культивирование на агаровых средах, на зерне, производство сыра и колбас, биокомпостирование и др.) осуществляются, как правило, на основе растительного сырья и используют чаще всего мицелиальные грибы или дрожжи. Различают три типа твердофазных процессов:

а) Поверхностные, когда слой субстрата не превышает 3-7 см. б) Глубинные процессы, идущие в не перемешиваемом слое. Биореакторы представляют собой глубокие открытые сосуды. в) Перемешиваемые процессы, протекающие в перемешиваемой и аэрируемой массе субстрата, который может быть гомогенным (полужидкой консистенции) или состоять из частиц твердого вещества, взвешенных в жидкости (переходный вариант от твердофазного процесса к процессу в жидкой фазе). Анаэробные процессы Биореакторы для таких процессов лишены приспособлении для аэрирования среды, хотя некоторые из анаэробных процессов сопровождаются потреблением газообразных продуктов водорода, метана, поэтому требуют соответствующих приспособлений для подачи газов в жидкую среду. Ведущим моментом является обеспечение анаэробиоза, что сопряжено со значительными сложностями.

22. Специализированные ферментационные процессы (анаэробные, твердофазные, газофазные). Анаэробные процессы Биореакторы для таких процессов лишены приспособлении для аэрирования среды, хотя некоторые из анаэробных процессов сопровождаются потреблением газообразных продуктов водорода, метана, поэтому требуют соответствующих приспособлений для подачи газов в жидкую среду. Ведущим моментом является обеспечение анаэробиоза, что сопряжено со значительными сложностями. Твердофазные процессы. Многие биотехнологические процессы основаны на взаимодействии трех фаз: твердой, жидкой и газообразной. Существуют процессы, в которых роль жидкой фазы сведена до минимума: она лишь используется для увлажнения твердой поверхности или воздуха (газа). В зависимости от превалирующей фазы процессы и соответствующие им аппараты подразделяются на твердофазные и газофазные. Твердофазные осуществляются, как правило, на основе растительного сырья и используют чаще всего мицелиальные грибы и дрожжи или их комбинации. Различают три типа твердофазных процессов: • Поверхностные, когда слой субстрата не превышает 3–7 см ("тонкий слой"). В качестве "биореакторов" используются большие (до нескольких квадратных метров) подносы или культуральные камеры. • Глубинные процессы, идущие в не перемешиваемом слое ("высокий слой"). Биореакторы представляют собой глубокие открытые сосуды. Для аэробных твердофазных процессов разработаны приспособления, обеспечивающие диффузионный и конвекционный газообмен. • Перемешиваемые процессы, протекающие в перемешиваемой и аэрируемой массе субстрата, который может быть гомогенным (полужидкой консистенции) или состоять из частиц твердого вещества, взвешенных в жидкости (переходный вариант от твердофазного процесса к процессу в жидкой фазе). Для этого обычно используют биореакторы с низкоскоростным перемешиванием. Преимущества по сравнению с процессами, осуществляющимися в жидкой фазе: 1) они требуют меньших затрат на оснащение и более дешевые в эксплуатации; 2) характер субстрата облегчает отделение и очистку продукта; 3) низкое содержание воды препятствует заражению культуры продуцента посторонней микрофлорой; 4) твердофазные процессы не связаны со сбросом в окружающую среду больших количеств сточных вод. Однако и здесь существуют свои проблемы. Вследствие отсутствия хорошего перемешивания продуцент часто растет в виде колоний и лишь постепенно может распространяться по субстрату; при этом возникает локальная недостача питательных веществ, тогда как часть субстрата вообще не используется (не колонизируется) продуцентом; недостаточно эффективный контроль за аэрацией и др. Газофазныепроцессы. Процессы этого типа осуществляются в аппаратах с твердым наполнителем, через который пропускают газ. В таких аппаратах получают, например, спирт на основе дрожжей, а также их биомассу, мелкие агрегаты дрожжевых клеток, предварительно увлажненные концентрированной питательной средой, "парят" в потоке газа, подаваемого под сильным давлением через сопло в днище реактора. Газ, покидающий аппарат, несет с собой летучие продукты жизнедеятельности дрожжей (в том числе и спирт), которые конденсируются в холодильнике. Процесс может осуществляться как в аэробных, так и в анаэробных условиях (в зависимости от используемого газа).

23. Проблемы масштабирования ферментационных процессов. Технология производственного процесса отрабатывается поэтапно: в лабораторных, пилотных (опытно-промышленных) и промышленных установках. Чаще встречаются аппараты с объемами ферменторной камеры: 0,5-100 л (лабораторные), 100-5000 л (лабораторно-промышленные) и 5000-1 000 000 л и более (промышленные). На каждом этапе увеличения масштаба ферментации решаются конкретные задачи отработки (налаживания) производства и его оптимизации. Лабораторные ферменторы по устройству и форме напоминают промышленные и подразделяются на те же типы. Правда, в лабораторных масштабах наиболее часто применяются аппараты с механическим перемешиванием. По принципу теплообмена и стерилизации они делятся на две категории. К первой относятся лишенные собственных системтеплообмена и стерилизации. Такие аппараты, по сути дела, представляют собой камеры для культивирования, помещаемые в водяные бани и стерилизуемые в автоклавах. Аппараты второй категории снабжены системами теплообмена и стерилизации, принципиально не отличающимися от таковых промышленных установок. С помощью лабораторных биореакторов решаются следующие задачи:

1) кинетические - определение скорости роста клеток, эффективности утилизации субстратов и образования целевого продукта;

2) некоторые массообменные - расчет коэффициентов массопередачи, скорость поступления в среду О2 и других газов, скорость освобождения от газообразных продуктов, образующихся при культивировании продуцентов (в первую очередь СО2);

3) определение коэффициентов реакций, связывающих утилизируемые субстраты и О2 с получаемыми целевым и побочными продуктами.

Пилотные установки используют для поиска (отсюда и название) наиболее целесообразных технологий и в общих чертах моделирование промышленного процесса. Поэтому на данном этапе стараются применять тот тип аппарата, который предполагается использовать в промышленном масштабе. Иными словами, отрабатываются все аспекты производства, вплоть до штатных вопросов. При масштабных переходах следует постоянно иметь в виду, что при соблюдении одинаковых условий (среда, тип аппарата, температура и рН, скорость перемешивания) уровень и скорость синтеза целевого продукта могут существенно различаться ситуация, очень четко прослеженная еще в 1940-1950 гг. при организации крупномасштабных производств антибиотиков. Вследствие сказанного при переходе от лабораторных к пилотным, а затем от пилотных к промышленным установкам, приходится наряду с объемом изменять и конструкцию, и режимы работы аппаратов. Центральной проблемой при этом является подбор надежных критериев масштабирования, обеспечивающих разработку высокоэффективных и экономичных технологий промышленного производства целевого продукта.

24. Биотехнология производства одноклеточного белка. БОО - это высококачественный продукт, т.к. содержание белка может достигать 60% от сухой массы. При этом такой продукт содержит определенное количество углеводов, витаминов, микро- и макроэлементов. Отсутствие посевных площадей. Процесс не зависит от погоды, климата, поддается точному планированию и автоматизации. Получаемые продукты стандартны, возможна утилизация промышленных отходов. Для микробного белка придумано специальное название — белок одноклеточных организмов (БОО). Производство его связано с крупномасштабным выращиванием определенных микроорганизмов, которые собирают и перерабатывают в пищевые продукты. В основе лежит технология ферментации — ветвь бродильной промышленности и производства антибиотиков. Чтобы осуществить возможно более полное превращение субстрата в биомассу микробов, требуется многосторонний подход. Выращивание микробов в пищевых целях представляет интерес по двум причинам. Во-первых, они растут гораздо быстрее, чем растения или животные: время удвоения их численности измеряется часами. Это сокращает сроки, нужные для производства определенного количества пищи. Во-вторых, в зависимости от выращиваемых микроорганизмов в качестве субстратов могут использоваться разнообразные виды сырья. Что касается субстратов, то здесь можно идти по двум главным направлениям: перерабатывать низкокачественные бросовые продукты или ориентироваться на легкодоступные углеводы и получать за их счет микробную биомассу, содержащую высококачественный белок. И в том и в другом случае технология ферментации играет ключевую роль. Здесь важно подобрать оптимальный состав среды, создать определенные условия для роста, разработать конструкции ферментеров, правила их эксплуатации и системы контроля, выработать методы отделения биомассы от культуральной среды. Промышленное производство белка одноклеточных организмов всегда осуществляется методом глубинного культивирования в жидких средах; применяются как одноэтапное, так и непрерывное культивирование. Непрерывное культивирование сложнее, чем одноэтапное, но более экономично: производительность ферментеров выше. Именно этот метод был избран для промышленного производства БОО.

25. Продуценты одноклеточного белка. В настоящее время известны только две группы микроорганизмов, которым присущи свойства, необходимые для крупномасштабного промышленного производства: это дрожжи рода Candida на n-алканах (нормальных углеводородах) и бактерии Methylophillusmethylotrophus на метаноле. Микроорганизмы можно выращивать и на других питательных средах: на газах, нефти, отходах угольной, химической, пищевой, винно-водочной, деревообрабатывающей промышленности. В современных биотехнологических процессах, основанных на использовании микроорганизмов, продуцентами белка служат дрожжи, другие грибы, бактерии и микроскопические водоросли. Наилучшими из них являются дрожжи. Их преимущество заключается прежде всего в "технологичности": дрожжи легко выращивать в условиях производства. Они характеризуются высокой скоростью роста, устойчивостью к посторонней микрофлоре, способны усваивать любые источники питания, легко отделяются, не загрязняют воздух спорами. Клетки дрожжей содержат до 25% сухих веществ. Наиболее ценный компонент дрожжевой биомассы - белок. Известно более 100 видов дрожжей, которые хорошо растут на крахмале как на единственном источнике углерода. Среди них особенно выделяются два вида, которые образуют как глюкоамилазы, так и β-амилазы, растут на крахмале с высоким экономическим коэффициентом и могут не только ассимилировать, но и сбраживать крахмал. В последнее время в качестве продуцентов белка стали использовать бактерии, которые отличаются высокой скоростью роста и содержат в биомассе до 80% белка. Бактерии хорошо поддаются селекции, что позволяет получать высокопродуктивные штаммы. Их недостатками являются трудная осаждаемость, обусловленная малыми размерами клеток, значительная чувствительность к фаговым инфекциям и высокое содержание в биомассе нуклеиновых кислот. Следующую группу продуцентов белка составляют грибы. Они способны утилизировать самое разнообразное по составу органическое сырье: мелассу, молочную сыворотку, сок растений и корнеплодов, лигнин и целлюлозосодержащие твердые отходы пищевой, деревообрабатывающей, гидролизной промышленности. Грибной мицелий богат белковыми веществами, которые по содержанию незаменимых аминокислот ближе всего к белкам сои. Вместе с тем белок грибов богат лизином,. Это позволяет на основе зерна и грибной биомассы составлять сбалансированные пищевые и кормовые смеси. Грибные белки имеют достаточно высокую биологическую ценность и хорошо усваиваются организмом. Источниками белковых веществ могут служить и водоросли. При фототрофном способе питания и образования биомассы они используют углекислый газ атмосферы. Выращивают водоросли, как правило, в поверхностном слое прудов, где с площади 0,1 га можно получить столько же белка, сколько с 14 га посевов фасоли. Белок водорослей пригоден не только для кормовых, но и пищевых целей. Хорошими продуцентами белка являются рясковые, которые накапливают протеина до 45% от сухой массы, а также до 45% углеводов. Скор аминокислотный — показатель биологической ценности белка, представляющий собой процентное отношение доли определенной незаменимой аминокислоты в общем содержании таких аминокислот в исследуемом белке к стандартному (рекомендуемому) значению этой доли. Для неполноценных белков принято находить незаменимую аминокислоту, которой не хватает больше других (лимитирующую), и рассчитывать ее скор - процентное содержание по отношению к теоретически необходимому количеству. Иногда скор находят для двух аминокислот.

26. Требования, предъявляемые к микробному белку и возможности его использования. Требования к белку: перевариваемость, питательность, экономическая эффективность при получении. В отношении экономической эффективности учитывается доступность сырья. Это означает возможность замены одних субстратов другими. БОО не должны содержать патогенных м/о, канцерогены, токсины, ионы тяжелых Ме. Одной из самых основных характеристик БОО явл. сбалансированность его состава. Для оценки этого показателя СКОР – ВОЗ рекомендует использовать как эталон белок куриного яйца и молока человека. При определении СКОР учитывается содержание незаменимых аминокислот, по отношению к общему содержанию каждого из них. Незаменимая аминокислота, которая встречается в наименьшем количестве называется 1-я незаменимая аминокислота (лимитирующая). Отношение процентного содержания этой аминокислоты в эталонном белке и исследуемом и называется СКОР. Получаемые БОО делят на 3 гр. по возможности использования. Белки технические (используются как добавки в корм пушных зверей, для приготовления микробиологических сред); Кормовые (в с/х); Пищевые – для человека – микопротеин – продуценты грибы рода Fruzarium, выращиваются на глюкозе и аммиаке, как источник C, N. После проведения ферментации культуральная жидкость подвергается вакуумной фильтрации и мицелий который образуется, высушивается и добавляется в пищу.

27. Сырьевая база производства белка одноклеточных организмов. Для получ. белка одноклеточных м/о используют разл. субстраты: парафины нефти, метан, водород, метанол, этанол, уксусную кислоту, углекислый газ, молочную сыворотку, мелассу, крахмал и целлюлозосодержащие отходы пром-ти и с/ха. В наст. время в микробиол. производствах белка применяется различное сахаросодержащее сырье. Это отходы пищевой, молочной, спиртовой, сахарной и целлюлозной промышленности и продукты переработки растительного сырья (древесины, соломы, торфа, несъедобных частей растений – стебли, лузга, кочерыжки). Питательные среды, приготовленные на основе перечисленных субстратов, содержат наборы моно- и дисахаров, органические кислоты, спирты и другие органические соединения, а также минеральные элементы, то есть являются сложными многокомпонентыми субстратами. Поэтому при их применении используют штаммы-продуценты, способные, во-первых, усваивать как пентозы, так и гексозы, и, во-вторых, – устойчивые к присутствию спиртов, фурфурола и других продуктов гидролиза растительных биомасс. Представляется перспективным привлечение в качестве субстрата для получения кормовых дрожжей продуктов совместного гидролиза растительного сырья и ила очистных сооружений. При этом питательная среда дополнительно обогащается аминокислотами растит. и жив. происхождения. Это увеличивает выход дрожжей и содержание в них белка. Сырьевая база производства микробного кормового белка расширяется также за счет использования гидролизатов торфа, кот. содержат в больших кол-вах легкоусвояемые моносахара, а также органич. к-ты. Среди новых источников сырья большой интерес представляют т. н. возобновляемые ресурсы углеводов, получаемые из лигнин-целлюлозных материалов. Было установлено, что м/оми могут усваиваться практически все классы углеводородов, очищенные жидкие парафины, масляные дистилляты и другие нефтепродукты. Субстраты III-го поколения – оксидады углеводородов, газообразные углеводороды, углекислота, водород.

28. Высокоэнергетические субстраты, отходы сельского хозяйства и других производств. Представляющие существенное коммерческое значение как источники энергии материалы (нефтегаз, метанол, этанол, метан и н- алканы) привлекают внимание биотехнологов как субстраты ряда биотехнологических процессов, главными участниками которых являются бактерии и дрожжи. Метанол как источник углерода для получения одноклеточного белка обладает многими преимуществами по сравнению с н-парафинами; в нем отсутствуют потенциальные токсичные вещества, он легко растворим в водной фазе в любых концентрациях и при культивировании на средах с метанолом в получаемой биомассе отсутствуют какие-либо остатки углерода (хотя бы потому, что он легко испаряется). Относительно благоприятная ситуация для производства одноклеточного белка на н-парафинах нефти сложилась в 70-е годы в бывшем Советском Союзе, что было связано с низкими внутренними ценами на нефть. Весьма подходящим сырьем для получения одноклеточного белка, предполагаемого к использованию в пищу человека, является этанол. Отходы растений, появляющихся в различного рода производствах: солома, выжимки, отходы цитрусовых, сыворотка молока, меласса, навоз животных и бытовые сточные воды служат субстратами для организмов- продуцентов. Во многих странах некоторая часть соломы, получающейся в сельскохозяйственных производствах, традиционно используется для компостирования с лошадиным навозом для получения субстрата, пригодного при выращивании грибов (Agaricuslisporus). Удаление лигнина из лигноцеллюлозы делает последнюю потенциальным источником энергии для жвачных животных, способных использовать ее в качестве пищи.

29. Ферментная технология. Ферменты являются сложными органическими соединениями, присутствующими в живых клетках, где они функционируют как катализаторы различных биохимических реакций превращений разных химических соединений. Хотя ферменты образуются только в живых клетках, многие из них могут быть выделены из клеток без потери активности и способны работать в условиях invitro. Ферментная технология включает продукцию, выделение, очистку, использование в растворенной форме и, наконец, применение в иммобилизованном виде ферментов в широком круге реакторных систем. Ферментная технология, вне всякого сомнения, обеспечит в будущем разрешение наиболее насущных проблем, стоящих перед обществом; например, обеспечением пищей, источниками энергии (ее сохранением и использованием с максимальной эффективностью), а также улучшением окружающей среды. Эта новая технология происходит из биохимии, но в значительной степени из микробиологии, химии и инженерных отраслей. Быстрое развитие ферментной технологии началось с середины 50-х годов на основе использования грибных (микробных) ферментов. Некоторые ферменты и области их применения

Фермент Применение

а-Амилаза -Пивоварение, производство спирта

Аминоацилаза-Получение L-аминокислот

Бромелаин- Размягчение мяса, осветление соков

Каталаза -Антиоксидант в готовых к употреблению пищевых продуктах

Целлюлаза-Получение спирта и глюкозы

Фицин-Размягчение мяса, осветление соков

Глюкоамилаза- Пивоварение, производство спирта

Глюкозоизомераза-Производство сиропов с высоким содержанием фруктозы

Глюкозооксидаза- Антиоксидант в готовых к употреблению пищевых продуктах

Инвертаза -Инверсия сахарозы

Лактаза- Утилизация сыворотки, гидролиз лактозы

Липаза -Сыроварение, получение ароматизаторов

Папанн-Размягчение мяса, осветление соков

Пектиназа-Осветление соков, производство спирта

Протеаза -Детергент, производство спирта

30. Область применения ферментов в биотехнологических производствах. По объему производства ферменты занимают третье место после аминокислот и антибиотиков. Из более чем 2000 известных в настоящее время ферментов в промышленности используется около 30. Основная часть ферментов, поступающих на мировой рынок, приходится на долю гидролаз, из которых 60 % составляют пептидогидролазы (в основном щелочные и нейтральные протеазы), испольующиеся в качестве детергентов в производстве синтетических мою-щих средств, а 30 % — гликозидазы, применяющиеся в производстве кондитерских изделий, фруктовых и овощных соков. Фермены находят применение в текстильной, кожевенной, целлюлозо- бумажной, медицинской, химической промышленности. По прогнозам ученых, основным потребителем ферментов в ближайшем будущем остается пищевая промышленность. Главное место среди этих энзимов занимают глюкоизомераза и глюкоамилаза, применяющиеся для приготовления обогащенных фруктозой кукурузных сиропов и составляющие около 50 % рынка пищевых энзиматических препаратов. Для деградации и модификации антропогенных органических соединений, поступающих в окружающую среду, используют фер­менты разных классов и в том числе лакказу, лигниназу, тирозиназу, монооксигеназу, диоксигеназу и др. Ферменты широко используют в медицине, например в заме­стительной терапии в составе лечебных препаратов.В последние годы накопились данные об эффективности применения протеиназ в энзимотерапии зло­качественных новообразований. Это объясняется большей проницае­мостью мембран раковых клеток для гидролитических ферментов в сравнении с нормальными клетками, благодаря чему опухоле­вые клетки быстро лизируются при введении смеси протеиназ (препарат «папайотин»). Важнейшую область применения ферментов в медицине со­ставляет энзимодиагностика — тестирование патологии того или иного органа человека по уровню активности фермента или соот­ношению его множественных форм и изоферментов.

31. Технология производства ферментов для промышленных целей.? Ферментные препараты представляют собой концентраты ферментов, полученные с помощью микроорганизмов, содержащие в своем составе наряду с ферментами балластные вещества. Ферментные препараты применяют в пищевых производствах как катализаторы соответствующих биохимических процессов. В качестве продуцентов ферментов используют разнообразные источники: растения, животные ткани и микроорганизмы. Способностью активно продуцировать целлюлолитические ферменты обладают представители ряда несовершенных грибов родов Alternaria, Trichoderma, Fusarium и др. Важным требованием к применяемому продуценту является его способность к образованию большого количества какого-либо одного фермента при незначительном количестве других ферментов. Микроорганизмы культивируют на средах, богатых углеводами, азотистыми и минеральными веществами, витаминами. В производстве ферментных препаратов используют синтетические и комплексные среды, являющиеся смесью синтетических сред с естественными материалами растительного, животного и микробного происхождения. Синтетические среды готовят из различных минеральных солей и органических соединений, являющихся источником углерода — углеводов, спиртов, органических кислот. В качестве естественных материалов применяют отходы пищевых производств: отруби, мелассу, жмыхи, кукурузный экстракт, солодовые ростки, пивные дрожжи, зерно-картофельную барду. Для накопления ферментов в культуральной среде необходимо обеспечить оптимальные условия для их синтеза: состав среды, температуру, значение рН, снабжение клеток кислородом воздуха. Для нужд пищевой промышленности вырабатываются амилолитические ферментные препараты. Препараты представляют собой тонкоизмельченные порошки бежевого или светло-серого цвета влажностью не более 13 %. Они хорошо растворимы в воде без постороннего запаха и вкуса. Протеолитические ферментные препараты используют в мясной промышленности для мягчения мяса, придания ему нежного вкуса и консистенции; в молочной промышленности — для получения гидролизатов белков молока, в пивоварении — для стабилизации пива от помутнения и др. Применяют два способа выращивания продуцентов ферментов: поверхностный и глубинный. Поверхностный способ предусматривает выращивание микроорганизмов на поверхности твердых, жидких, полужидких или сыпучих материалов. Этот способ создает хорошие условия для максимального контакта микроорганизмов с кислородом воздуха. Его используют в основном при выращивании мицелиальных грибов. Глубинный способ предусматривает выращивание микроорганизмов на жидких средах. Этот способ применяют преимущественно при использовании в качестве продуцентов ферментов бактерий и других микроорганизмов, способных интенсивно развиваться в условиях недостаточного контакта клеток с кислородом. Он может быть применен и для культивирования аэробных микроорганизмов.

32. Требования, предъявляемые к продуцентам ферментов.? Ферментные препараты представляют собой концентраты ферментов, полученные с помощью микроорганизмов, содержащие в своем составе наряду с ферментами балластные вещества. Ферментные препараты применяют в пищевых производствах как катализаторы соответствующих биохимических процессов. В качестве продуцентов ферментов используют разнообразные источники: растения, животные ткани и микроорганизмы. Способностью активно продуцировать целлюлолитические ферменты обладают представители ряда несовершенных грибов родов Alternaria, Trichoderma, Fusarium и др. Важным требованием к применяемому продуценту является его способность к образованию большого количества какого-либо одного фермента при незначительном количестве других ферментов. Микроорганизмы культивируют на средах, богатых углеводами, азотистыми и минеральными веществами, витаминами. В производстве ферментных препаратов используют синтетические и комплексные среды, являющиеся смесью синтетических сред с естественными материалами растительного, животного и микробного происхождения. Синтетические среды готовят из различных минеральных солей и органических соединений, являющихся источником углерода - углеводов, спиртов, органических кислот. В кач-ве естественных материалов применяют отходы пищевых производств: отруби, мелассу, жмыхи, кукурузный экстракт, солодовые ростки, пивные дрожжи, зерно-картофельную барду. Для накопления ферментов в культуральной среде необходимо обеспечить оптимальные условия для их синтеза: состав среды, температуру, значение рН, снабжение клеток кислородом воздуха. Для нужд пищевой промышленности вырабатываются амилолитические ферментные препараты. Препараты представляют собой тонкоизмельченные порошки бежевого или светло-серого цвета влажностью не более 13 %. Они хорошо растворимы в воде без постороннего запаха и вкуса. Протеолитические ферментные препараты используют в мясной промышленности для мягчения мяса, придания ему нежного вкуса и консистенции; в молочной промышленности — для получения гидролизатов белков молока, в пивоварении — для стабилизации пива от помутнения и др. Применяют два способа выращивания продуцентов ферментов: поверхностный и глубинный. Поверхностный способ предусматривает выращивание микроорганизмов на поверхности твердых, жидких, полужидких или сыпучих материалов. Этот способ создает хорошие условия для максимального контакта микроорганизмов с кислородом воздуха. Его используют в основном при выращивании мицелиальных грибов. Глубинный способ предусматривает выращивание микроорганизмов на жидких средах. Этот способ применяют преимущественно при использовании в качестве продуцентов ферментов бактерий и других микроорганизмов, способных интенсивно развиваться в условиях недостаточного контакта клеток с кислородом. Он может быть применен и для культивирования аэробных микроорганизмов.

33. Иммобилизованные ферменты и преимущества их применения в биотехнологии. Иммобилизация – физическое разделение биообъекта (клетка, фермент) и

растворителя, то есть биообъект закреплен на нерастворимом носителе, а субстрат и продукты свободно обмениваются между биообъектом и растворителем. Иммобилизация ферментов – это перевод их в нерастворимое состояние с сохранением (частичным или полным) каталитической активности. Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ: 1.Такие ферменты представляют собой гетерогенные катализаторы, легко отделяющиеся от реакционной среды;2. Могут использоваться многократно;
3.Обеспечивают непрерывность каталитического процесса.
Кроме того, иммобилизация ведёт к изменению свойств фермента:- Субстрактной специфичности;- Устойчивости;
- Зависимости активности от параметров среды.
Иммобилизованные ферменты долговечны и в десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65°С термоинактивациялактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60%-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативнымферментом. Это обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты. Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ: 1.отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;2.снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции;3.более высокая активность и стабильность;4.возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов;5.способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов.

34. Способы иммобилизации ферментов.... Методы иммобилизации ферментов 2 осн. метода иммобилизации ферментов: физич. и химич. Физич. иммобилизация ферментов предст. собой включение фермента в такую среду, в кот. для него доступной явл-ся лишь ограниченная часть общего объема. При физич. иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Сущ. 4типа связывания ферментов: адсорбция на нерастворимых носителях; включение в поры геля; пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с пом. полупроницаемой мембраны; включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз. Адсорбционная иммобилизация. Этот способ достигается при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки неадсорбировавшегося белка иммобилизованный фермент готов к использованию. Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий м/у носителем и поверхностными группами белка. Вклад каждого из типов связывания зависит от химич. природы носителя и функциональных групп на поверхности молекулы фермента. Преимуществом метода явл. доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в роли носителей. Им также можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость. Важным фактор - простота применяемых методик. К недостаткам следует отнести отсутствие общих рекомендаций, позволяющих сделать правильный выбор носителя и оптим. усл. иммобилизации конкретного фермента. Для иммобилизации ферментов в геле сущ. 2 осн. способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в рез-те чего образуется полимерный гель с включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле 2двойные связи) сшивающие агенты, кот. придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки. В другом случае фермент вносят в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние. Общий принцип иммобилизации ферментов с использованием мембран заключается в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой перегородкой. Полупроницаемая мембрана легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но непреодолима для крупных молекул фермента. Существующие модификации этого метода разл. лишь способами получения полупроницаемой мембраны и ее природой. Водный раствор фермента можно включать внутрь микрокапсул, представл. собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (микрокапсулирование). При двойном эмульгировании получается водная эмульсия из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие капли водного раствора фермента. Если вместо водонерастворимого отвердевающего полимера используются жидкие углеводороды с высокой молекулярной массой, метод называется иммобилизацией путем включения в жидкие мембраны. К модификациям метода иммобилизации ферментов с использ. полупроницаемых оболочек отн. также включение в волокна (при этом вместо капель, содержащих ферменты, получаются нити) и включение в липосомы. Метод достаточно универсален. Осн. недостаток мембранных систем - невозможность ферментативного превращения высокомолекул. субстратов. При иммобилизации ферментов с использование систем двухфазного типа ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы достигается благодаря его способности растворяться только в одной из фаз. Субстрат и продукт ферментативного превращения распределяются между обеими фазами в соответствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного процесса. Одним из важн. преимуществ систем двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных субстратов, кот. невозможны при применении жестких носителей с ограниченным размером пор. Гл. отличительным признаком хим. методов иммобилизации явл. то, что путем химич. взаимодействия на стр-ру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности м/у белком и носителем.

35. Инженерная энзимология как современное направление биотехнологии. Инженерная энзимология – одно из направлений промышленной биотехнологии. Энзимы (или ферменты) являются универсальными белками-катализаторами, с помощью которых осуществляются все процессы в живой клетке. Инженерная энзимология – наука, разрабатывающая методы создания высокоэффективных ферментов для промышленного использования. Создание так называемых иммобилизованных (неподвижно закрепленных на синтетических полимерах, полисахаридах и других носителях-матрицах) энзимов явилось значительным шагом в развитии современной биотехнологии. Иммобилизация энзимов повышает их устойчивость к нагреванию, изменению реакции среды, увеличивает срок их действия, облегчает отделение их от продуктов реакции, дает возможность использовать многократно. Иммобилизация позволяет осуществлять непрерывные каталитические процессы, получать продукцию, не загрязненную энзимом. Это очень важно в ряде пищевых и фармакологических производств. Данный метод применяют для получения антибиотиков, например на основе иммобилизованного энзима – пенициллинамидазы, что позволяет снижать расход сырья и себестоимость продукта, увеличивать объем производства. Такие энзимы перспективны в химической промышленности, при получении тканей, кожи, бумаги, при производстве сахара для диабетиков, некоторых гормональных препаратов, в пищевой промышленности для получения сиропа, улучшения качества молока и ряде других производств. В медицине иммобилизованные энзимы перспективны в борьбе с опухолями, тромбами. Энзимы используются в технологических процессах пищевой промышленности: для получения глюкозно-фруктозного сиропа, глюкозы из крахмала, улучшения качества молока и ряде других производств. Проходит промышленную проверку технология переработки целлюлозы в глюкозу. Разработаны методы экономичных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов, при этом не требуется выделять и очищать энзимы. Иммобилизованные клетки микроорганизмов позволяют получать ряд ценных веществ: аминокислот, антибиотиков, органических кислот, стероидов, спиртов и др. Они исп. также для очистки сточных вод, переработки с/хозяйственных и промышленных отходов.

36. Цели и методы генной инженерии, этапы ее развития. Генная инженерия – это сумма методов, позволяющих переносить гены из одного организма в другой, или – это технология направленного конструирования новых биологических объектов. Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Основные методы генной инженерии были разработаны в 60-80е г.г.ХХв.. Сущность методов генной инженерии заключается в том, что в генотип организма встраиваются или исключаются из него отдельные гены или группы генов. В результате встраивания в генотип ранее отсутствующего гена можно заставить клетку синтезировать белки, которые ранее она не синтезировала. Они включают 3 основные этапа: 1. получение генетического материала; либо искусственный синтез генов, либо выделение природных генов; 2. включение этих генов в векторную молекулу, т.е. в автономно реплецирующуюся генетическую структуру, и создание рекомбинантной

молекулы ДНК; 3. введение векторной молекулы с включенным в нее геном в клетку реципиент, где она встраивается в хромосомный аппарат. Экспериментальныйперенос генов в другой геном называется трансгенезом. Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа: Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК invitro. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование. Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности. Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-реципиента) генов эукариот, главным образом, животных. Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойерс сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам. На данный момент совершено два фундаментальных открытия: Первое – это возможность работать с изолированными генами. Она получена благодаря выделению гена в чистом виде и синтезу его. Второе достижение – это доказательство включения чужеродной информации в геном, а также функционирования его в клетках высших животных и человека.

37. Получение трансгенных организмов. Трансгенный организм - организм, геном кот. содержит чужеродный ген. материал, включенный методами генной инженерии. Трансгенные организмы - животные, растения, м/о, вирусы, генетическая программа кот. изменена с применением методов генной инженерии. Получение трансгенных организмов предст. собой альтернативу традиционным методам селекции жив. и раст. Необходимые условия для осуществления генной инженерии: 1. Нужен такой биообъект, который способен синтезировать чужеродный белок, воспринимал бы и передавал генетическую информацию. 2. Организм человека не должен отторгать продукт, синтезированный продуцентом. 3. Клетка должна делиться, необходимо, чтобы гены, продуцирующие целевой продукт у клеток, образующихся после деления, экспрессировались (работали). 4. Необходимо иметь транспортное устройство для внесения ДНК в клетку продуцента: вектор в виде плазмид, космиды, фага. Вектор вводится разными путями: 1. коньюгация – генетический материал клеток при сближении переходит из одной клетки в др. в виде плазмиды. 2. трансдукция – передача клетке генетического материала через вирус или фаг. 3. трансформация – передача клетке генетического материала изолированной ДНК, в результате чего изменяется геном. Процесс трансформации – перенос ген. материала, при кот. фрагмент ДНК, выделенный из клетки донора, поступает в клетку-реципиент. В генной инженерии включение нового гена происх. с пом. фермента рестриктазы. Рестриктаз в клетке может быть очень много. Рестриктазы разрушают фосфодиэфирные связи м/у нуклеотидами в строго определенном месте, т.е. они обладают строгой специфичностью, действуя на определенную посл-ть нуклеотидов в цепи. После разрыва связей образуются «липкие концы» и в разрывы включаются гены с помощью ферментов ДНК-лигаз, кот. соединяют нуклеотиды м/у собой. Рестриктаза действует в строго определенной последовательности на одну нить ДНК. Другая рестриктаза расщепляет вторую нить ДНК на другом участке. Рестриктазы расщепляют ковалентные фосфодиэфирные связи м/у нуклеотидами. После расщепления связей образуются «липкие концы» и в место разрыва можно включить ген, кот. «сшивается с ДНК с пом. ДНК-лигаз.

38. Культивирование клеток высших растений. Метод культуры клеток высших растений лежит в основе изучения биологии клетки, существующей вне организма. Популяциям растительных клеток, выращиваемым в искусственных условиях, присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференциальной активности генов) и физиологические. При длительном культивировании гетерогенной по этим признакам популяции наблюдается преимущественное размножение клеток, фенотип которых наиболее соответствует данным условиям выращивания, и популяция эволюционирует. Изменчивость, наследуемость возникших изменений, адаптивный отбор и эволюция, свойственные культивируемым клеткам растений, позволяют считать, что они являются новой экспериментально созданной биологической системой, особенности которой пока еще мало изучены. Однако знать их очень важно, потому что культивируемые клетки высших растений широко используются в фундаментальных исследованиях и в практике. Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения. Отличия культивируемых клеток от клеток организма, часто специально усиленные созданием биохимических мутантов, гибридных или трансформированных клеток - помогают глубже проникнуть в механизм процессов происходящих в растениях. Простота клеточных моделей, возможность быстро получать достаточную массу в асептических, контролируемых по многим параметрам условиях выращивания являются преимуществами такого моделирования. На основе культивируемых клеток и тканей растений созданы технологии для промышленности и сельского хозяйства. Углубление знаний биологии культивируемых растительных клеток обязательно для дальнейшего прогресса в разработках принципиально новых, перспективных для практики технологий.

39. Культивирование одиночных и гаплоидных клеток. Гаплоидные растения используют для получения стабиль­ных гомозиготных линий. Для мутагенеза также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном уровне облегчается отбор рецессивных мутаций. В диплоидных растениях мутации редко затрагивают оба аллельных гена в гомологичных хромосомах. Особь обыч­но гетерозиготна (два гена различаются), при этом проявля­ется действие только доминантного (но не рецессивного) ге­на. Поскольку мутации чаще рецессивны, чем доминантны, их довольно сложно выявить. В гаплоидных же растениях, которые содержат только одну из каждой пары гомологич­ных хромосом, мутации проявляются немедленно. Существует три способа получения гаплоидов с исполь­зованием метода культуры изолированных тканей: андрогенез — получение гаплоидных растений на ис­кусственной питательной среде из изолированных пыльни­ков и микроспор; гиногенез — получение гаплоидных растений на ис­кусственной питательной среде из изолированных семяпочек; партеногенез — получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом ро­дителей потеряны отцовские хромосомы. Гаплоидные эмбриоиды, образовавшиеся в результате элиминации хромосом отцовского генома, культивируют на искусственных питательных средах и получают гаплоидные растения. Возможны два пути образования гаплоидных растений в культуре пыльников:

— образование растений путем эмбриогенеза в пыль­цевых зернах. При этом внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен возникают эмбриоиды. Они прорастают и дают гаплоидные растения; образование каллуса из клеток пыльника. В даль­нейшем в результате морфогенеза из каллусных клеток ре­генерируют растения. В этом случае образовавшиеся расте­ния не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности. До конца не выяснено, образуются ли они от полиплоидизированных гаплоидных клеток или от слив­шихся клеток. Культивирование одиночных клеток Вопрос о генетической неоднородности легче решать, используя клон – потомство одной клетки, а не гетерогенную ткань исходного экспланта. Для выделения одиночных клеток используют низкоагрегированные суспензии, из которых отбирают отдельные клетки. Однако идеальный способ получения одиночных клеток заключается в использовании изолированных протопластов после восстановления ими клеточной стенки. При культивировании одиночных клеток потребовалась выработка специальных методов. Все они основаны на использовании так называемого «кондиционирующего фактора» — метаболитов, выделяемых в среду делящимися клетками. Когда на питательную среду высаживается одна клетка или небольшое их количество, они не делятся, так как выделяемого кондиционирующего фактора не хватает для индукции деления. Следовательно, необходимо повысить концентрацию фактора в питательной среде. Этой цели служат следующие методы: 1. Метод ткани-«няньки» — кондиционирующий фактор выделяется находящимися рядом с одиночной клеткой кусочками ткани-«няньки». 2. Метод «кормящего слоя» — кондиционирующий фактор выделяют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка. 3. Кондиционирование среды — осуществляется путем добавления в нее питательной среды, отфильтрованной от интенсивно делящихся клеток. 4. Метод культивирования одиночных клеток — осуществляется в микрокапле, т.е. в очень малом объеме (=20 мкл) богатой питательной среды. Точно сказать, что представляет собой кондиционирующий фактор, пока невозможно.

40. Культуры изолированных протопластов. Изолированный протопласт — это содержимое растительной клетки, окруженное плазмалеммой. Целлюлозная стенка у данного образования отсутствует. Протопласты позволяют исследовать различные св-ва мембран, а также транспорт веществ через плазмалемму. Главное их преиму­щество состоит в том, что в изолированные протопласты достаточ­но легко вводить генетическую информацию из органелл и клеток других растений, прокариотических организмов и из клеток жи­вотных. Большое значение в создании новых форм растений для изуче­ния взаимодействия ядерного генома и геномов органелл имеет способность изолированных протопластов сливаться, образуя гиб­ридные клетки. Таким способом можно добиться получения гиб­ридов от растений с разной степенью таксономической удален­ности, но обладающих ценными хозяйственными качествами. Впервые протопласты были выделены Дж. Клернером в 1892 г Современный метод вы­деления протопластов заключается в удалении клеточной стенки с помощью поэтапного использования ферментов для ее разруше­ния: целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы. Этот метод получил название ферментативного. Для культивирования протопластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Отличительной чертой сред для протопластов является повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования, которое обеспечивается высокой концентрацией маннита или СаС1₂. В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. На формирование колоний протопластами влияет состав питательной среды. Дальнейшая задача - получение из каллусной ткани растений-регенерантов. Пока не удалось получить регенеранты из протопластов многих злаковых (пшеницы, ячменя). Однако успешно осуществляется регенерация из протопластов пасленовых (табак, картофель, томаты) и других культур. Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой и целлюлозой Изолированные протопласты можно культивировать. Обычно для этого используют те же среды, на которых растут изолирован­ные клетки и ткани. Сразу же после удаления ферментов у прото­пластов в культуре начинается образование клеточной стенки. Протопласт, регенерировавший стенку, ведет себя как изолиро­ванная клетка, способен делиться и формировать клон клеток. Регенерация целых растений из изолированных протопластов со­пряжена с рядом трудностей. Получить регенерацию через эмбрио­генез удалось пока только у растений моркови. Стимуляцией пос­ледовательного образования корней и побегов (органогенез) до­бились регенерации растений табака, петунии и некоторых дру­гих растений. Следует отметить, что протопласты, изолированные из генетически стабильной клеточной культуры, чаще регенери­руют растения и с большим успехом используются при исследо­ваниях генетической модификации протопластов.

41. Методы создания клеточных культур растений. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей invitro условно можно подразделить на две группы. Первую группу составляют вспомогательные технологии: оплодотворение invitro(преодо­ление прогамной несовместимости); культивирование семя­почек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости); получение гаплоидных рас­тений путем культивирования пыльников и микроспор; клональноемикроразмножение отдаленных гибридов. Вторую группу составляют основные методы, которые ведут к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции получению новых форм и сортов расте­ний на основе соматической гибридизации, слияния изоли­рованных протопластов, клеточной селекции и других ме­тодических подходов. Оплодотворение invitro (преодоление прогамной не­совместимости) проводят при невозможности осуществить оплодотворение между выбранными парами растений в ес­тественных условиях.Оплодотворение invitro можно осуществить культиви­рованием завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой на искусственной агаризованной питательной среде. Преодоление постгамной несовместимости. Постгам­ная несовместимость при отдаленной гибридизации возни­кает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхож­дение во времени развития зародыша и эндосперма.В таких случаях из зер­новки изолируют зародыш и выращивают его в питатель­ной среде. Данный способ выращивания называется эмбрио­культурой.

Получение гаплоидных растений invitro. Существует три способа получения гаплоидов с исполь­зованием метода культуры изолированных тканей: андрогенез — получение гаплоидных растений на ис­кусственной питательной среде из изолированных пыльни­ков и микроспор; гиногенез — получение гаплоидных растений на ис­кусственной питательной среде из изолированных семяпочек; партеногенез — получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом ро­дителей потеряны отцовские хромосомы. Основные методы invitro в селекции растений Соматическая гибридизация — создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, по­лученных из соматических клеток. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены дале­ких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке ци­топлазматические гены партнеров. Слияние изолирован­ных протопластов. Отличительной чертой питательных сред для протопластов является повышенное осмотическое дав­ление на начальных этапах культивирования, которое обес­печивается высокой концентрацией маннита или СаС1₂. В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку (через 48 ч с момен­та выделения протопластов) и превращаются в клетки, спо­собные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. Протопласты выделяют из каллусных, суспензион­ных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. Слияние изолированных протопластов может происхо­дить спонтанно, но это случается довольно редко. В каче­стве индуктора служил нитрат натрия. Но этот метод ока­зался малоэффективным, и сейчас найдены другие фьюзо- гены (индукторы слияния). Наиболее эффективными из них оказались растворы с высоким pH (9-11) и высокой концентрацией ионов кальция (100-300 мМ).Слияние протопластов приводит к образованию либо цибрида, либо гибрида. Цибридная клетка содержит цито­плазму обоих партнеров, а ядро — одного.Изоли­рованные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы; следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток.

42. Методы выращивания культуры каллусных клеток. В зависимости от способа, условий культивирования и проис­хождения можно выделить несколько типов культур клеток и тка­ней. Если культивирование происходит поверхностно на агаризованной пит ср, то обркаллуснаятк.Каллусные клетки в культуре могут спонтанно приобретать гормоно независимость, природа которой может быть следствием мутации или результатом экспрессии генов, определяющих независимость клетки от гормонов. Каллусная клетка, при делении которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет один из типов клеточной дифференциации, свойственной высшему растению. В исключительных ситуациях у нормального растения может возникать каллусная ткань (случается при травмах), которая функционирует непродолжительное время, защищая растение в участке повреждения и накапливая питательные вещества для регенерационного процесса. Для получения культивируемых каллусных клеток кусочки тканей различных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду в пробирках или чашках Петри, соблюдая правила стерильности. Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу, не имеющую определенной анатомической структуры, цвет которой может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусных ткани бывают:1) рыхлыми, сильно оводнен, рассыпчатыми;2) средней плотности, 3) плотными. Каллусные ткани, выращиваемые поверхностным способом применяются для поддержания в растущем состоянии коллекций различных штаммов, линий, мутантов; из них получают суспензии клеток для культивирования в жидкой питательной среде, а также для регенерации растений.

43. Поверхностное и суспензионное культивирование. Существует несколько типов культур клеток и тканей растений, в зависимости от способа их получения, условий культивирования и происхождения. Если культивирование происходит на плотной поверхности питательной среды, со­держащей агар, то образуется каллусная ткань. Каллус («мозоль») может образовываться как на изоли­рованных кусочках ткани (эксплантах) в условиях invitro, так и на растении при поранении. Каллусная культура — это неорганизованная пролифе­рирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. Известный ученый-ботаник Н. Кренке установил, что в интактном растении каллусная ткань выполняет следующие функции: защитные (защищает места повреждений); запасные (запасание питательных веществ, синтез вторичных соединений); регенерационные (регенерация утраченных органов — корней, побегов). В основном каллусы имеют белый или желтоватый цвет. Реже отмечается их светло-зеленая окраска и очень редко — интенсивно-зеленая. Темно-коричневая окраска чаще возникает при старении каллусных клеток и связана с накоплением в них окисленных фенольных соединений. Для предотвращения этого процесса или его снижения в питательные среды вносят антиоксиданты. Каллусная ткань обычно аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, хотя она может быть разной плотности, в зависимости от происхождения и условий вы-ращивания(рыхлая,средней плотности,плотная). Любой тип плотности каллусной ткани можно превра­тить в другой, используя для этого следующие приемы: заменяя один ауксин на другой; изменяя концентрацию ауксина в питательной среде; увеличивая или уменьшая концентрацию соли хлори­да кальция в питательной среде; добавляя в питательную среду ферменты (если необ­ходимо получить каллусную ткань рыхлого типа). Обязательным условием дедифференцировки раститель­ной клетки и превращения ее в каллусную является при­сутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызыва­ют процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению, а цитокинины — пролиферацию (деление) дедифференцированных клеток. Суспензионные культуры — это отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде (рис. 3.9, см. цв. вклейку). Они представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко подвергнуть воздействию химических веществ. Суспензию клеток получают путем перенесения в жидкую среду каллусной ткани, предварительно выросшей на твердой агаризованной питательной среде.Для отделения крупных агрегатов клеточ­ную массу перед пересевом фильтруют или отстаивают, а затем помещают в жидкую среду с автоматическим переме­шиванием. В лабораторных условиях клетки суспензии выращивают в колбах на качалке. Скорость вращения 100-120 об/мин. В таких условиях обеспечивается аэрация тканей и нарас­тающая масса клеточных агрегатов распадается на отдель­ные фрагменты.

Суспензионную культуру можно получать и непосред­ственно из первичного экспланта (лист, стебель, корень и т. д.). Для этого применяют ферменты, напримерпектиназу.

Обязательным условием культивирования клеточных суспензий является постоянное перемешивание или встря­хивание среды. Исключение из питательной среды ионов кальция облегчает суспензирование. Еще более облегчает этот процесс добавление в питательную среду фермента пектиназы, которая разрушает пектат кальция, склеивающий отдельные клетки. При промышленном культивировании суспензионных культур применяют закрытые или открытые системы с пе­риодическим или проточным режимом выращивания кле­ток. В закрытой системе клеточная суспензия лишена при­тока свежей питательной среды до конца выращивания (пе­риодическая культура), а в случае непрерывного режима выращивания в открытой системе питательную среду частично меняют на свежую. Как при периодическом, так и при проточном режиме выращивания в открытой системе клетки остаются в пита­тельной среде и не удаляются даже при ее замене. Однако в открытых системах культивирования при замене питатель­ной среды вместе со средой отбирается и часть суспензион­ных клеток.