Стр. 150

Стр. 149

Формула 6-3

Надписи к формуле:

1 — разность электрических потенциалов по разные стороны мембраны

2 — толщина мембраны

=============================

Ы! Верстальщик! Вставить рис. 6-2. ИК

(6-3)

Рис. 6-2. Формирование водной поры ионным каналом. Диэлектрическая постоянная воды (e=80) в 40 раз больше диэлектрической постоянной липидного бислоя (e=2).

=============================

Стр. 149

Рис. 6-2

Надписи на рисунке:

1 — Водный раствор

2 — Внешнее устье ионного канала

3 — Внутреннее устье ионного канала

4 — Наполненная водой зауженная часть канала

5 — Липидный бислой

6 — Цитозоль

7 — Внеклеточное пространство

8 — Гидратированный дипольными молекулами воды катион

=============================

При условии, что V_m =0,1 В, а толщина клеточной мембраны составляет 4 нм (то есть 40´10^–8 см), величина электрического поля будет около 250 000 В/см. Таким образом, несмотря на незначительное трансмембранное напряжение, мембрана клетки фактически выдерживает очень большое электрическое поле. Позже мы рассмотрим, как электрическое поле влияет на активность специфического класса мембранных сигнальных белков, названных потенциалозависимыми ионными каналами (см. главу 7).

Мембранный потенциал покоя клеток скелетной мускулатуры, кардиомиоцитов и нейронов находится в пределах от –60 до –90 мВ; потенциал покоя гладкомышечных клеток приблизительно равен - 55 мВ, V_m человеческого эритроцита — всего лишь около -9 мВ. Некоторые бактерии и клетки растений имеют трансмембранное напряжение, равное 200 мВ. В очень маленьких клетках, таких как эритроциты человека, в мелких внутриклеточных органеллах (типа митохондрий) и тончайших клеточных отростках (таких, как синаптические окончания нейронов) невозможно измерить трансмембранный потенциал непосредственно с помощью микроэлектрода. В таких случаях используют спектральные методы, которые позволяют косвенно измерить мембранный потенциал этих недоступных мембран (рис. 6-3B). В этом случае клетку или её мембрану маркируют определённой молекулой органического красителя с последующим мониторированием спектра поглощения или флуоресценции краски. Оптический сигнал молекулы красителя может быть независимо откалиброван как функция V_m. Независимо от того, измерен V_m непосредственно микроэлектродом или косвенно при помощи спектральной техники, фактически все биологические мембраны имеют мембранный потенциал, отличный от нуля. Таким образом, трансмембранный потенциал — важнейший фактор, определяющий течение любого физиологического транспортного процесса, обусловленного движением заряда.

Измерения V_m показали, что большинство клеток электрически возбудимы. К возбудимым клеткам можно отнести нейроны, скелетные мышечные клетки, кардиомиоциты, секреторные клетки поджелудочной железы. В таких клетках в ответ на электрическое или химическое возбуждение возникают характерные временные изменения V_m. Электрические и оптические методы измерения V_m регистрируют практически идентичные реакции в теле клетки при её возбуждении (рис. 6-3C). Оптический метод позволяет изучить изменение мембранного потенциала на отростках нейрона и сравнить его с изменениями мембранного потенциала в теле клетки, что невозможно при исследовании данного процесса микроэлектродом (рис. 6-3D). Когда клетка неактивна, V_m обычно имеет значение, которое называют потенциалом покоя. В следующем разделе мы рассмотрим, как возникает мембранный потенциал, для того чтобы понять, что лежит в основе клеточной активности.

Ы! Верстальщик! Вставить рис. 6-3. ИК

Рис. 6-3. Регистрация мембранного потенциала. [С и D — источник (с изменениями): Crinvald A. Real-time optical mapping of neuronal activity: From single growth cones to the intact mammalian brain // Annu Rev. Neurosci. — 1985. — Vol. 8. — P. 263–305. © Annual Reviews www.annualreviews. org.]

=============================

Стр. 150

Рис. 6-3

Надписи на рисунке:

A

1 — МИКРОЭЛЕКТРОДНАЯ ТЕХНИКА

2 — Нейрон

3 — Аксон

4 — Тело клетки

5 — Отростки (дендриты)

6 — Ядро

7 — На вольтметре значение мембранного потенциала

B

8 — МЕТОД С ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ КРАСИТЕЛЕМ

9 — Источник света

10 — Дихроическое зеркало

11 — Фотодетектор

12 — Флюоресцентное окрашивание мембраны

13 — Интенсивность излучённого красного света пропорциональна величине мембранного потенциала (мВ)

C

14 — СОПОСТАВЛЕНИЕ МИКРОЭЛЕКТРОДНОГО И ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО МЕТОДОВ

15 — Мембранный потенциал (мВ), измеренный микроэлектродом

16 — Стимул

17 — Значения эл. тока

18 — Микроэлектрод

19 — Краситель

Время (мс)

20 — Значения флуоресценции

D

21 — МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ПЕРИКАРИОНА И ОТРОСТКОВ

22 — Тонкие отростки

23 — Значения флуоресценции

24 — Время (мс)

=============================

Мембранный потенциал создается трансмембранным градиентом концентрации ионов

В главе 5 мы рассмотрели концепцию строения клеточной мембраны и отметили, что некоторые интегральные мембранные белки служат электрогенными транспортёрами, через которые идет ток ионов, за счёт чего возникает электрический потенциал на мембране. Один из классов электрогенных транспортёров включает АТФ-зависимые ионные насосы (ионные помпы). Эти белки используют энергию гидролиза АТФ, чтобы создавать и поддерживать трансмембранные градиенты ионных концентраций. В клетках животных Na⁺/K⁺- и Ca²⁺-помпы (насосы) ответственны за поддержание нормальных градиентов концентрации ионов Na⁺/K⁺ и Ca²⁺. Реакции, катализированные этими ион-транспортирующими ферментами, электрогенны, поскольку приводят к возникновению заряда на мембране клетки. К примеру, Na⁺/K⁺-помпа (насос) откачивает из клетки три иона Na⁺ в обмен на два иона K⁺, идущих в клетку, при этом из клетки суммарно выходит один положительный заряд. В дополнение к электрогенным насосам клетки могут экспрессировать на своей мембране вторично активные транспортёры, которые также электрогенны. К ним относятся котранспортеры сопряжено переносящие Na⁺/глюкозу (см. главу 5).

Кажется, что отрицательный V_m на внутренней поверхности клеточной мембраны поддерживается непрерывной работой электрогенных Na⁺/K⁺-насосов, откачивающих из клетки положительно заряженные ионы. Однако в гигантских клетках, имеющих высокое отношение поверхности к объёму, ионные градиенты снижаются медленно, и потенциал покоя сохраняется в течение долгого времени, даже когда АТФ-зависимый энергетический метаболизм блокируется метаболическими ядами. Это открытие предполагает, что АТФ-зависимый насос не является непосредственным источником энергии, обеспечивающим мембранный потенциал. Потенциал покоя гигантского аксона кальмара равен –60 мВ. Когда Na⁺/K⁺-насос в мембране гигантского аксона специфично блокируется сердечными гликозидами (см. главу 5), V_m изменяется всего лишь на 1,4 мВ. Таким образом, в большинстве случаев, непосредственный вклад электрогенной компоненеты Na⁺/K⁺-насоса в величину потенциала покоя очень мал. Главная роль насоса заключается в поддержании перепадов концентраций ионов калия и натрия между внутренней и наружной средами клетки.

Действительно, ряд экспериментов показал, что мембранные потенциалы клетки зависят от градиентов концентрации ионов. В классическом эксперименте Пол Горовиц (Paul Horowicz) и Алан Ходжкин (Alan Hodgkin) измерили V_m мышечного волокна лягушки с помощью внутриклеточного микроэлектрода. Мышечное волокно омывалось физиологическим раствором, в котором ионы SO₄^2– заменялись на ионы Сl^– (манипуляция, которая устраняет влияние анионов на V_m). В присутствии нормальных для амфибий внеклеточных концентраций ионов K⁺ и Na⁺ ([K⁺]_o = 2,5 мМ и [Na⁺]_o = 120 мМ), мышечное волокно находилось в состоянии покоя, и потенциал покоя был равен приблизительно -94 мВ. Если [K⁺]_o повышалась больше чем на 2,5 мМ за счёт замены ионов K⁺ на Na⁺, то V_m изменялся в положительном направлении. Если [K⁺]_o снижалась менее чем на 2,5 мМ, то V_m становился более отрицательным (рис. 6-4). При повышении [К⁺]_o больше 10 мМ мембранный потенциал, измеренный на рис. 6-4, приближался к линейной функции логарифма [K⁺]_o. Многочисленные, подобные описанным выше эксперименты демонстрируют, что непосредственным источником энергии мембранного потенциала служит не активная перекачка ионов, а скорее потенциальная энергия, сохраненная непосредственно в градиентах концентрации ионов. Конечно, ионные насосы (и вторично активные транспортёры, которые получают свою энергию из насосов) ответственны за то, что производят и поддерживают определённые ионные градиенты.

Один из методов исследования влияния градиентов концентрации ионов на V_m изучает этот феномен в in vitro (в пробирке). Многие ученые использовали искусственную модель клеточной мембраны, названную плоским липидным бислоем. Эта система состоит из перегородки с отверстием диаметром 200 нм, которая разделяет две камеры, заполненные водными растворами (рис. 6-5). Можно закрасить плоский липидный бислой, имеющий толщину всего 4 нм в области отверстия, таким образом изолируя разделение камер. Интегрируя в плоский липидный бислой мембранные белки и другие молекулы, можно изучать особенности этих белков и их функции, исключив влияние сложного метаболизма живых клеток. Трансмембранное напряжение плоского липидного бислоя может быть измерено с помощью вольтметра, связанного с парой электродов Ag/AgCl, которые через солевые мостики находятся в электрическом контакте с растворами по обе стороны мембраны. Это экспериментальное устройство напоминает внутриклеточную регистрацию напряжения, за исключением того, что обе стороны мембраны полностью доступны для манипуляций.

Ы! Верстальщик! Вставить рис. 6-4. ИК

Рис. 6-4. Зависимость мембранного потенциала покоя мышечного волокна лягушки от внеклеточной концентрации ионов K⁺. Линейная часть кривой расположена выше значения 58 мВ при 10-кратном увеличении [K⁺]₀. На оси абсцисс значения [K⁺]₀ даны в логарифмической шкале. (Источник: Hodgkin A.L., Horowicz P. The influence of potassium and chloride ions on the membrane potential of single muscle fibers // J. Physiol. [Lond.]. — 1959. — Vol. 148. — P. 127–160)

=============================