Основні етапи виготовлення гістологічних препаратів

Процес виготовлення постійних гістологічних препаратів включає в себе ряд послідовних етапів: одержання матеріалу, фіксація, промивання, зневоднення, ущільнення, заливка, виготовлення зрізів, фарбування.

Перший етап під час виготовлення препарату – одержання матеріалу. На цьому етапі слід уникати зайвого травмування об'єктів. Тому для попередження небажаного розм'якшення тканин необхідно користуватися гострими ножицями, або лезом. В жодному випадку не стискати тканину пінцетом. Шматочки органів беруться невеликих розмірів - близько 1 см³ (7×7×3 мм). Матеріал повинен бути свіжим, брати його треба якомога швидше після забивання експериментальної тварини.

Для збереження тканинної та цитологічної будови шматочків органів їх необхідно зафіксувати. Тому другий етап виготовлення гістологічних препаратів – фіксація матеріалу. Фіксація проводиться шляхом занурення взятого шматочка у фіксувальну рідину. Метою даного етапу є закріплення гістологічних структур у тому місці і стані, у якому вони були в живому об'єкті. Фіксацію проводять при температурі розчину від +4° до +37°C. Об’єм фіксатора повинен у 20–40 разів перевищувати масу шматочків. Найкращим фіксатором вважається 10–15%-й водний розчин формаліну. Фіксація триває від 24 год. і більше.

Промивання. Під час промивання видаляється надлишок фіксатора. При фіксації формаліном промивання проводять проточною водою протягом 24–48 год.

Наступний етап – зневоднення, забезпечує видалення води з матеріалу. Для зневоднення використовують спирти різних концентрацій, що зростають від 50-70⁰ до 100⁰. У кожному спирті потрібно витримувати матеріал від 1 до 24 год., залежно від розмірів шматочків.

Зневоднення є необхідним для наступного етапу – ущільнення об'єкта. Більшість фіксованих і обезводнених об’єктів не мають властивостей, необхідних для одержання з них зрізів. Для цього їх необхідно ущільнити за допомогою заливки у відповідні середовища. Найбільш розповсюдженим ущільнюючим середовищем є парафін. Перед заливкою шматочків матеріалу в парафін його проводять через проміжні розчинники (абсолютний сприт, ксилол, хлороформ, толуол). Для цього дегідратовані шматочки переміщують у суміш рівних частин ксилолу і абсолютного спирту (2–3 год.), а після цього – в чистий ксилол (2–3 год.). Далі шматочки занурюють на 1 год. в суміш розплавленого парафіну і ксилолу (при температурі 37°С), потім на 1–3 год. у розплавлений парафін (при температурі 56°С). Після цього шматочки вміщують у паперові форми і заливають розплавленим парафіном. Застиглі парафінові блоки закріплюють на дерев’яні бруски.

Ущільнення матеріалу дає змогу виготовити з нього гістологічні зрізи. Виготовлення зрізів проводять на спеціальних приладах, які називаються мікротоми. Головними складовими їх частинами є станина, утримувач мікротомного ножа, об’єктоутримувач, механізм мікроподачі та мікротомний ніж. На мікротомах одержують зрізи завтовшки від 2 до 20 мкм. Одержані зрізи наклеюють на предметне скло.

Фарбування зрізів. Існує багато способів фарбування гістологічних препаратів. Різне забарвлення виявляє різноманітні структури клітин, тканин і органів, що обумовлено їх специфічними фізико-хімічними властивостями. Барвники, що застосовуються в гістологічній практиці бувають рослинні, тваринні і синтетичні. Прикладом рослинних барвників є гематоксилін, який одержують з кори кампешевого дерева. Прикладом тваринних барвників є кармін, який отримують з комах кошенілі. Абсолютна більшість барвників є синтетичними – еозин, фуксин, азур.