Слияние мембран при экзоцитозе

Рассмотрим процесс экзоцитоза на примере тучных клеток, секретирующих гистамин, гепарин и серотонин. Эти клетки и находящиеся в них гранулы настолько велики, что с помощью электронной микроскопии удается наблюдать весь ход экзоцитоза, который проиллюстрирован схематически на рис. 1. В исходном состоянии мы имеем клетку и секреторную гранулу (состояние 1), удаленную от плазматической мембраны. В ответ на определенный стимул гранула приходит в тесный контакт с плазматической мембраной (состояние 2).

На микрофотографии можно увидеть, что в зоне контакта плазматическая мембрана выгибается в сторону гранулярной, образуя так называемый димпл, вершина которого представляет собой сильно искривленную мембрану. В этой области, порядка 10 нм, липидные участки гранулярной и плазматической мембран находятся в близком контакте. Предполагается, что именно здесь происходят слияние мембран и образование поры слияния (состояние 3), которая обеспечивает возможность выхода содержимого гранулы в окружающую среду. Таким образом, слияние подразумевает объединение мембран и установление связи через пору слияния между внутригранулярным пространством и внеклеточной средой. На электронных микрофотографиях удается увидеть только достаточно крупные поры, около 50 нм в диаметре. Стенки этих пор образованы сильно изогнутыми липидными бислоями. В окрестности поры слияния видны белковые макромолекулярные структуры, в том числе нитевидные образования, построенные из актина. Предполагается, что именно они способствуют образованию димплов.

К сожалению, с помощью электронной микроскопии не удается зарегистрировать малую пору, чтобы разобраться в механизме ее образования в ходе перезамыкания исходных мембран. Принципиально новые возможности открылись после того, как был разработан метод пэтч-клампа (отведение тока при помощи микропипетки), который произвел буквально революцию в клеточной биологии.

Метод пэтч-клампа достаточно прост. Крошечная стеклянная микропипетка прижимается к плазматической мембране до тех пор, пока не образуется плотный контакт, обеспечивающий электрическую и химическую изоляцию внутренности пипетки от окружающего раствора. Кусочек мембраны, который находится на кончике пипетки, разрушается, в результате чего возникает электрический и химический доступ внутрь клетки (рис. 2).

Усилитель тока, включенный между двумя электродами, один из которых находится в пипетке, а другой – в окружающем клетку растворе, позволяет поддерживать определенный мембранный потенциал и измерять электрический ток, состоящий из омической и емкостной компонент. Последняя отвечает переносу ионов, которые необходимы для заряжения мембранной емкости до определенного потенциала. Полный перенесенный заряд пропорционален площади мембранного конденсатора. Следовательно, если с плазматической мембраной сливается гранула, находящаяся в цитоплазме, и тем самым увеличивается суммарная площадь клеточной поверхности, это может быть обнаружено методом пэтч-клампа путем регистрации емкостного тока. Зарядка мембранного конденсатора гранулы происходит через пору слияния, проводимость которой определяет кинетику емкостного тока. Регистрируя этот ток как функцию времени, можно установить, как именно изменяется радиус поры.

Измерения показали, что пора открывается скачком, ее радиус при этом составляет 0,2 нм, затем она закрывается, открывается вновь и, наконец, размер поры начинает быстро нарастать. Измерения емкости гранулы на стадии быстрых переходов между открытым и закрытым состояниями поры показали, что площадь гранулы за это время заметно возрастает. Этот рост достигается за счет переноса ~10^-5 липидных молекул из плазматической мембраны в мембрану гранулы. Из этого наблюдения следует, что стенки самых малых пор выстланы липидами, что обеспечивает связность системы по липидной компоненте и значительный липидный поток, движущей силой которого является, по-видимому, разность натяжений между плазматической мембраной и мембраной гранулы. Эти результаты служат дополнительным аргументом в пользу предположения, что слияние мембран происходит в области вершины димпла, стенки образующейся поры слияния включают в свой состав липиды и, возможно, какие-то белки (комплекс SNARE), причастные к процессу слияния.

Таким образом, формирование тесного локального контакта мембран – это функция белка. Однако, остается вопрос: достаточно ли свести липидные бислои на близкое расстояние, чтобы они самопроизвольно слились? Ответить на него удалось с помощью бислойных липидных мембран (БЛМ).