Использование фагов в исследовании "состояния" бактерий

Старение - это фундаментальное свойство, внутренне присущее всем живым организмам. Считается, что во многих отношениях старение целого организма можно рассматривать как реализацию наследственной информации во времени, как продолжение непрерывного процесса развития от ювенильности к зрелости, хотя в нем есть и такие особенности, истоки которых не удается обнаружить на ранних стадиях развития. Полагают, что у растения, например, старение зависит от физиологического механизма, который связан с мобилизационными взаимоотношениями между отдельными его частями.

Относительно эволюционной древности и обязательности этого свойства для всех живых систем нет единого мнения, поскольку эти системы находятся на различных уровнях организации в физиологическом (даже "социальном") смысле. Несомненным, однако, является существование старения клона, популяции и других более сложных уровней организации живых систем. Поэтому в исследованиях, затрагивающих вопросы возрастной физиологии живых систем, важно иметь возможность выражать степень " организованности" живой системы через какую-либо характеристику (характеристики). Предпринята попытка найти один из способов проявления такой характеристики. Для решения поставленной задачи необходимо было выбрать факторы воздействия на живую систему, ко

торые могли бы выявить ее специфику.

Коснемся еще одного, важного, по нашему мнению, вопроса. Экспериментальные данные, полученные на разрушенных объектах, часто не отражают истинного течения тех или иных процессов в условиях временной и пространственной организации живой системы. Это связано и с тем, что свойства кооперативной системы (живые системы относятся к кооперативным), организованной из отдельных макромолекул, не являются простой суммой свойств этих макромолекул. В такой системе проявляются качественно новые свойства, характерные для нового уровня структурной организации. Поэтому необходимо использовать методы получения информации без разрушения живой системы, а также применить фактор, действие которого носит направленный биологический характер. В качестве фактора были использованы фаги, многие стороны существования которых хорошо изучены. Отметим, что при встрече фага с клеткой бактерии-хозяина не всегда происходит явное развитие заболевания. Наиболее подробно изучены в этом плане так называемые Т-четные фаги. Полное сходство с ними по морфологическим признакам обнаруживают цианофаги - вирусные агенты, поражающие цианобактерии.

Задачей исследования было оценить диапазон возможностей предложенных в работе методов анализа нативных клеток при изучении реакции цианобактерий на присутствие фага в среде как в случае их контактов, так и до момента их механического взаимодействия; кроме того, представляли интерес данные, характеризующие так называемую степень организованности культуры в случае изменения взаимодействия системы культура+среда с фагом на разных этапах развития заражения.

Объектами исследования служили цианобактерии Anacystis nidulans и Anabaena variabilis, не образующие гетероцист и спор, и цианофаги AS-I и А-I(L) (цианофаги были любезно предоставлены сотрудниками лабораторий С.В.Шестакова и Б.В.Громова). Культивирование цианобактерий проводили в стационарных условиях на среде Кратца-Майерса при 2000 лк и температуре 30 ±2^О С.

Адсорбцию цианофагов на клетки проводили при встряхивании на качалке без дополнительного освещения в течение 30 мин. Затем контрольные и опытные варианты помещали в люминостат с освещенностью 2000 лк при температуре 25 ±2^ОС. Спектральные характеристики регистрировали в динамике, для чего отбирали пробы через 1, 15, 30 мин после введения фага в среду, а также через 1, 2, 3, 24 ч. Методы регистрации спектров в поляризованном свете и использование их в экспериментах с неразрушенными клетками описаны в предыдущих разделах работы.

Запись спектров вели параллельно для культуры с фагом и контрольной культуры без фага. Степень реакции культуры на присутствие в среде фага определяли сравнением спектральных характеристик со спектрами контрольной культуры, а также по изменениям интенсивности полос поглощения и дихроичных отношений в области полос амид 1 и амид 2. Стабильность измерений проверяли по характеристикам, полученным при параллельном измерении одинаковых культур в отборе параллельных проб через разные промежутки времени.

Таблица 4.1

Результаты определения дихроичных отношений для полосы амид 1 при трех измерениях (табл. 4.1) свидетельствуют о том, что максимальная ошибка измерения с учетом биологического расхождения в параллельных пробах (1,2) не превышала 5-6%. Все отклонения в опыте от данных для контрольной культуры, которые превышали 5-6%, считали за реакцию культуры на присутствие в среде цианофага.

Было проведено две серии экспериментов. В первой серии использовали 12-дневную культуру А. variabilis, содержавшую 1,2 _*10 ⁷ кл/мл при соотношении фаг/клетка 4 частицы на клетку. Параллельно была инфицирована разведенная в 10 раз культура при том же соотношении фага и клеток. Опыты показали, что быстрее подвергалась лизису более концентрированная культура. В результате сравнения спектральных характеристик опытных и контрольных культур в тех же концентрациях установлено, что на начальном этапе изменения спектров менее концентрированной культуры при введении цианофага в среду выражены сильнее, чем изменения спектров более концентрированной культуры (области 1550 и 1300-1500 см ^-1). Однако через несколько часов изменения характеристик в области 1300-1500 см ^-1 концентрированной культуры также становятся значительными (рис. 4.1).

Во второй серии экспериментов были изучены изменения в спектрах указанных культур при введении в систему культура+среда цианофагов в разных концентрациях. Были использованы культуры с исходной концентрацией 1,2 _*10 ⁷ кл/мл при соотношении фаг/клетка в пробах, равном 4/1, и при уменьшенной концентрации фага в 5, 20 раз, в отдельных пробах в

100 раз. Во всех без исключения случаях зарегистрированы изменения в спектрах при действии цианофага. Нас интересовало, будут ли изменения в спектрах (которые отражают реакцию культуры на действия фага) пропорциональны концентрации фага в среде. Мы провели расчет дихроичных отношений для полос амид 1 (А1) и амид 2 (А2), которые и сопоставили в случае разных концентраций фага в среде.

Рис. 4.1. Изменение спектральных характеристик зараженных фагом концентрированной (А) и разбавленной (Б) культур Anabaena varifbilis:

׀ – через 15 мин после заражения,

׀׀ – через 60 мин после заражения,

׀׀׀ – через 3,5 ч после заражения,

1 – контрольная культура,

2 – зараженная фагом культура

Из расчетных данных, полученных на основании результатов экспериментов (табл. 4.2), следует, что найти пропорциональную или количественную зависимость между изменениями концентраций фага в среде и характером изменений дихроичных отношений полос амид 1 и амид 2 (что отражает степень реакции живой системы) очень трудно. Это взаимодействие носит сложный биологический характер и вряд ли может быть описано математически.

Таблица 4.2

Таким образом, разбавленная культура на введение в среду цианофага реагирует сильнее, чем концентрированная, хотя при сильном разбавлении системы фаг+клетки количество контактов фагов и клеток должно уменьшаться и реакция культуры должна была бы стать меньшей. Можно предположить, что 12-дневная культура представляет собой своего рода организм и начальное взаимодействие (адсорбция) цианофага с клетками не находит пока в достаточной степени своего отражения в реакции организма, так как еще существенно не нарушена его система регуляции. При сильном разбавлении культуры нарушается система регуляции, характерная для организма, т. е. нарушается целостность системы клетка+среда. Поэтому при введении в среду цианофага мы регистрируем в опыте ответ отдельных клеток. Эта система, вероятно, более лабильна, и сразу наблюдается реакция именно клеток (а не организма) на фаг, хотя количество контактов может быть меньше, чем в опыте с концентрированной культурой.

Такое предположение подтверждает и проведенный следующий опыт. В менее концентрированную культуру после ее выдерживания в стандартных условиях культивирования в течение нескольких часов был введен цианофаг. Реакция культуры на введение фага в среду была несколько задержана во времени. Вероятно, культура "успела" приобрести некоторые "свойства организма". В точности такая же картина наблюдается на спектрах концентрированной исходной культуры.

Увеличение реакции культуры через несколько часов после культивирования, вероятно, объясняется тем, что за этот промежуток времени действие цианофага нарушило также и организменную систему регуляции, и культура на это резко отреагировала.

Результаты изучения изменений спектров цианобактерий при введении в систему культура+среда фагов различных концентраций подтверждают сложный биологический характер реакции живой системы на присутствие в среде цианофага. Известно, что на исход взаимодействия хозяина и паразита влияет физиологическое состояние культуры. В связи с этим интерес представляет дальнейшее исследование реакции различных культур бактерий на отдельных этапах их развития при введении в среду фага.

Представленные результаты указывают на то, что фаги могут быть использованы в качестве "инструмента" исследования состояния, поведения, степени организованности культуры клеток на различных этапах ее развития.