Анализ гетерогенности культуры клеток при регистрации изменения градиента биохимических компонентов клеток

На примере галофильных микроорганизмов рассматривается возможность изучения отличий делящихся клеток гетерогенной и синхронной культур при регистрации изменений градиента концентрации биохимических компонентов нативных клеток с помощью анализа изменений интенсивности полос поглощения, изменений отношений интенсивностей полос поглощения и дихроичных отношений.

Для решения ряда практических задач биотехнологии используются синхронные культуры микроорганизмов.

В данном разделе предлагаются некоторые подходы сравнения синхронной и несинхронной культур на примере галофильных микроорганизмов.

В работе был использован метод НПВО в инфракрасном диапазоне. Этот диапазон широко используется в биотехнологических исследованиях процессов культивирования.

Для получения синхронной культуры суточную культуру НаlоЬасtrium halobium выращивали по методике. За показатель однородности клеток в культуре был принят размер клеток. Центрифугированием на проточной центрифуге С-44 удавалось получить инокулят с клетками одного размера. Полученный биологический материал выращивали в колбах на качалке при температуре 38^оС. нализ проб проводили каждый час после начала эксперимента и продолжали 8-10 ч.

Примененный метод НПВО для сравнения синхронной и несинхронной культур позволяет получить информацию о наличии биохимических компонентов, идентифицируемых по их характеристическим полосам поглощения как в целой клетке, так и в заранее определенном слое клетки.

Существенные различия синхронной и несинхронной культур галлофилов на спектрах обнаруживаются в области поглощения 1430-1480 см ^-1. В литературе нет четкой идентификации этих полос поглощения для спектров целых клеток, поэтому вопрос их интерпретации подлежит еще решению. С нашей точки зрения, найденные отличия в этой области для практических целей представляют интерес тем, что она наиболее лабильна во времени. Это дает основание для ее использования при изучении действия внешних факторов на культуры как способа получения информации об их состоянии. Именно в этой области наиболее ярко проявляется реакция клеток многих других культур на воздействие. Для делящейся синхронной культуры галофилов отличия спектров от гетерогенной того же возраста наиболее заметны. Это наводит на мысль об использовании процесса деления клеток синхронных культур как способа получения информации о ходе технологических процессов.

Отличия синхронной и несинхронной культур обнаружены и при расчете соотношения полос поглощения 1660 и 1550 см ^-1 , полученных для перпендикулярной составляющей плоскополяризованного света. В табл. 2.1 приведены расчетные данные для трех периодов развития культуры. Периоды определены при подсчете клеток в камере Горяева. Из таблицы видно, что соотношение указанных полос для синхронной и несинхронной культур значительно отличается также в период деления.

Рис. 2.1. Спектральные характеристики синхронной культуры:

1 – спектр с глубины ~ 0,2 мкм,

2 – спектр с целых нативных клеток

На рис. 2.1 представлены спектры НПВО неразрушенных клеток и "срезов" этих же клеток с глубины 0,2 мкм. Обращает на себя внимание различие в спектрах в областях 1240 см ^-1 (в сновном приписываемой нуклеиновым кислотам) и 1740 см ^-1 (приписываемой липидам). Так в спектре "среза" клеток полоса 1240 см ^-1 практически отсутствует, а в целых клетках она интенсивная. Полоса же 1740 см ^-1 значительно интенсивнее для "среза" клеток и менее интенсивна для спектра целых клеток. Эти данные согласуются с биохимическими анализами практически для любых микроорганизмов. Таким образом, если выбрать глубину проникновения светового потока в так называемую среднюю по размерам клетку примерно между серединой этой клетки и клеточной стенкой, то отклонение интенсивности поглощения в области 1240 см ^-1 от интенсивности этой полосы для "средней" клетки должно характеризовать изменение гетерогенности, в частности, по размерам. Справедливость этого предположения проверяли при сравнении синхронной и несинхронной культур. По синхронной культуре подбирали параметры измерительного элемента такими, чтобы полоса 1240 см ^-1 не наблюдалась. В спектре несинхронной культуры того же возраста четко видна полоса, интенсивность которой в процессе роста и развития может изменяться и в связи с изменением размеров клеток. Появление этой полосы наблюдали и при рассинхронизации культуры, т. е. при увеличении ее гетерогенности. Проводимый подсчет клеток в культуре подтвердил появление несинхронного деления клеток. Регулируя глубину проникновения светового потока можно, вероятно, изучать и гетерогенность культуры, связанную с нестабильностью пространственного положения биополимеров в клетке. Измеряя изменение соотношения полос поглощения (например, амид 1 и амид 2), также можно получить представление о биохимической гетерогенности культуры в процессе развития.

Таблица 2.1

Остановимся еще на одной возможности анализа. В табл. 2.1 представлены средние из пяти измерений данные расчетов дихроичных отношений спектров с разных глубин проникновения света для синхронной и несинхронной культур. Ранее было показано, что клеткам свойственна определенная степень упорядоченности находящихся в них биополимеров, которая исчезает для слоя, затрагивающего лишь клеточную стенку и мембрану, что, можно полагать, является следствием скрытой анизотропии. Результаты, представленные в данном разделе, для несинхронной культуры практически совпадают со сказанным выше, а для синхронной - значительно отличаются: для синхронной культуры анизотропия наблюдается даже в тех областях поглощения, где она не выявлена для несинхронной. Этот факт подтверждает предположение о наличии скрытой анизотропии, которая, возможно, является также следствием гетерогенности несинхронной культуры клеток. Наиболее существенные отличия и в этом случае наблюдаются во время деления клеток синхронной культуры. При рассинхронизации культуры величины дихроичных отношений практически стали совпадать с величинами, характеризующими несинхронную культуру.

Полученные результаты дают основание предположить, что изменения, происходящие в клетках в период деления, можно использовать для получения информации при изучении популяций, в том числе и об уровне "организованности" различных культур клеток в процессе развития. Кроме того, является перспективным использование синхронных культур клеток в качестве одного из "инструментов " исследования поведения популяций микроорганизмов при изменении внешней среды.