Механизм свертывания крови

Разделение механизма свертывания крови на два пути – внутренний (контактная фаза свертывания) и внешний существовало по крайней мере три десятилетия от начала 60-х годов XX века, когда был предложен каскадный механизм реакций образования тромбина.

Контактная фаза свертывания крови.

Контактная активация свертывания крови инициируется in vivo при воспалении, in vitro при контакте плазмы с отрицательно заряженной поверхностью.

На отрицательно заряженной поверхности происходит сборка ассамблеи факторов XII, XI и прекалликреина вместе с кофактором фактора XI и рецептором прекалликреина -высокомолекулярным кининогеном (Рис 5). Связывание фактора XII с отрицательно заряженной поверхностью изменяет конформацию молекулы и делает ее более чувствительной к активации. Фактор XII превращается в активную сериновую протеиназу, фактор XIIa, аутокаталитически или под действием другой протеиназы – калликреина. Активаторами превращения прекалликреина плазмы в калликреин могут служить ряд протеиназ: фактор XIIa (реципроктная активация), матриксные металлопротеиназы (ММР), которые появляются в участке повреждения сосуда и воспаления из предшественников - ПроММР, а также пролилкарбоксипептидаза, фермент инактивирующий ангиотензин II и обеспечивающий взаимодействие калликреиновой и ренин-ангиотензиновой систем. Появившийся калликреин быстро расщепляет неактивный фактор XII в фактор XIIa в реакции положительной обратной связи, которая кинетически более эффективна, чем аутоактивация фактора XII. Калликреин расщепляет высокомолекулярный кининоген (ВМК), освобождая вазоактивный пептид- брадикинин (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg), сильный вазодилататор, который повышает сосудистую проницаемость, стимулирует ноцицептивные рецепторы и вызывает сокращение ряда гладких мышц (например, подвздошной кишки).

Структурные особенности фактора XII (см.выше) свидетельствуют о его многофункциональности. Основная функция фактора XII -активация фактора XI. Фактор XI состоит из двух идентичных цепей с высокой степенью гомологии прекалликреину. Подобно прекалликреину он существует в кровотоке в комплексе с ВМК. ВМК обеспечивает связывание фактора XI c отрицательно заряженной поверхностью и способствует его активации протеиназами, фактором XIIа, XIа и тромбином,каждый их которых расщепляет в мономерах фактора XI пептидную связь Arg369-Ile370.

Фактор XI активирует фактор IX в IXa. На уровне IX фактора объединяются внутренний и внешний пути свертывания. Физиологическое значение внутненнего пути не ясно, хотя участие контактной фазы в процессах воспаления не вызывает сомнений. Показано,что недостаточность фактора XII не ведет к кровоточивости,напротив обнаружена склонность к тромбообразованию. Приобретенная недостаточность факторов контактной фазы выявлена у пациентов с новообразованиями, сепсисом, аллергическими реакциями. Пептид, брадикинин, освобождаемый из ВМК калликреином, является модулятором тонуса сосудов. Образование фактора IXa -общая стадия внутреннего и внешнего пути, согласно устаревшему представлению о механизме свертывания крови в нормальном физиологическом процессе гемостаза.

2.4 Внешний путь свертывания крови – основной механизм образования тромбина в кровотоке.

К настоящему времени доказано, что внешний путь свертывания крови, индуцируемый тканевым фактором, является основным механизмом образования тромбина в кровеносном русле (Рис 3). Стимулом к активации внешнего пути свертывания служит экспонирование на поверхности поврежденных клеток сосудистой стенки тканевого фактора, называемого так же тромбопластином (син. фактор III свертывания крови).

Существуют два пути образования комплекса тканевого фактора с фактором VIIa свертывания крови. Первый – прямое связывание тканевого фактора с фактором VIIa, присутствующим в кровотоке в очень низкой концентрации (1% фактора VII) в конформации, не позволяющей ему контактировать с плазменными факторами свертывания и активировать их. Тканевой фактор – аллостерический активатор фактора VIIa, связывает фактор,изменяет его конформацию и каталитические свойства, повышая протеолитическую активность протеиназы в отношении специфических субстратов – факторов IX и X свертывания крови в несколько тысяч раз.

Второй путь – связывание тканевым фактором фактора VII крови, последующее превращение его в активную форму (VIIa), расщеплением одной пептидной связи Arg152-Ile153 фактором Xa и образование активной двухцепочечной молекулы фактора VIIa, субединицы которой соединены дисульфидной связью.

Тканевой фактор (CD142)– 47кДа трансмембранный гликопротеин, член суперсемейства рецепторов цитокинов класса II со значительной степенью гомологии с классом рецепторов интерферона. Тканевой фактор имеет одну полипептидную цепь, состоящую из N-концевого внеклеточного домена (219 а.о. (аминокислотных остатков)), гидрофобного трансмембранного участка (29 а.о.) и С-концевого внутриклеточного “хвоста” (21 а.о.). Внеклеточная часть молекулы тканевого фактора состоит из двух доменов, подобных доменам типа III фибронектина. Заякоревание тканевого фактора на мембране клетки существенно для связывания с высоким сродством факторов VII /VIIa, поддержки протеолитической активности фактора VIIa и инициирования свертывания крови.

Клетки, контактирующие с кровью, такие как эндотелиальные клетки, моноциты в норме не экспрессируют тканевой фактор, формируя дефицитный по тканевому фактору барьер между фактором VIIa и внесосудистыми его источниками.

Тканевой фактор конститутивно экспрессируется клетками субэндотелия, а также фибробластами и ГМК. Тканевой фактор обнаружен в адвентиции сосудов и в перицитах микрососудов мозга. На лейкоцитах и клетках эндотелия тканевой фактор экспонируется в ответ на воспалительные стимулы и повреждение клеток. Тканевой фактор может содержаться в циркулирующей крови в микрочастицах, освобождаемых при активации клеток, и в a-гранулах тромбоцитов в неактивной форме и/или в очень низкой концентрации.

Моноциты, активированные при воспалении, синтезируют тканевой фактор, которой заякорен в специализированных микродоменах, так называемых “ липидных плотах”. Эти домены служат источником микрочастиц, богатых фосфатидилсерином и тканевым фактором. Микрочастицы, транспортирующие тканевой фактор, адгезируют с активированными тромбоцитами, нейтрофилами и моноцитами, концентрируются в участке повреждения сосуда и иммобилизованный тканевой фактор стимулирует тромбообразование.

Тканевой фактор обнаружен в микрочастицах в крови больных инфарктом миокарда, антифосфолипидным синдромом, сепсисом и др.

Итак, тканевой фактор служит кофактором и рецептором сериновой протеиназы - фактора VIIa и профермента – фактора VII. Фактор VIIa в комплексе с тканевым фактором (ТФ/VIIa) запускает каскад активации проферментов в активные протеазы и активирует рецепторы PAR на фибробластах, эпителиальных и эндотелиальных и других клетках.

Образование сериновых протеаз гемостаза. Фактор VII- зависимый от витамина К, одноцепочечный, гликозилированный мультидоменный белок (406 а.о.), содержит N-концевой g-карбоксиглутаминовый домен (Гла-домен), содержащий 10 остатков g-карбоксиглутаминовой кислоты, гидрофобный стек, два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF-домены), и каталитический (протеазный) домен, гомологичный трипсину и химотрипсину по аминокислотной последовательности. Доменная структура молекулы белка и организация гена фактора VII подобны таковым других витамин К зависимых факторов – IX, X, протеина С и протеина S (Рис).

Рентгеноструктурным анализом кристаллической структуры комплекса растворимой формы тканевого фактора (лишенной трансмембранного и цитоплазматического домена) и ингибированного по активному центру фактора VIIa показано, что фермент, связанный с мембраной через Гла-домен, имеет протяженные контакты с тканевым фактором. Тканевой фактор подобен стержню, включенному в фосфолипидные везикулы мембраны, вокруг которого “закручивается” молекула фактора VIIa. Основные участки контакта фактора VIIa с тканевым фактором локализованы в первом EGF домене и каталитическом домене, а дополнительные точки контакта – в гидрофобном стеке, Гла-домене и втором EGF домене. Благодаря такому контакту комплекс ТФ/VIIa ориентирован перпендикулярно поверхности мембраны.

Тканевой фактор изменяет локализацию и ориентацию активного центра фактора VIIa относительно мембраны: расстояние от активного центра фермента до мембраны уменьшается, что способствует эффективному расщеплению пептидных связей субстратов (факторов X и IX), также связанных с мембраной через Гла-домены.

Взаимодействие фактора VII с тканевым фактором является зависимым от ионов кальция(Са²⁺). Девять участков молекулы фактора VII участвуют в связывании Са²⁺: семь сайтов в Гла-домене, один – в EGF I домене и еще один в каталитическом домене. Для высокоаффинного связывания фактора VII с тканевым фактором очень важно низкоаффинное(Kd < 1mM) связывание Са²⁺ с Гла-доменом.

Комплекс ТФ/VIIa связывает фактор X и превращает его в фактор Xа.

В отличие от других зависимых от витамина К факторов протромбинового комплекса фактор X состоит их двух цепей, соединеных дисульфидной связью. Легкая цепь (139ао) содержит в структуре N-концевой Гла-домен с 11 остатками g-карбоксиглутаминовой кислоты, гидрофобный стек, два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF-домены), в первом их которых локализован β-гидроксилированный Asn63. Тяжелая цепь(306 ао), содержащая все углеводы фактора X, содержит на N-конце гликозилированный пептид активации (52ао) и каталитический ( протеазный) домен.

ТФ/VIIa образуя тройной комплекс с фактором X (ТФ/VIIa/X) расщепляет его со скоростью в 2х10⁷ раз большей, чем свободный фактор VIIa. Комплекс ТФ/VIIa отщепляет N- концевой пептид активации, гидролизуя одну связь Arg194-Ile195 в тяжелой цепи, что приводит к образованию каталитически активного фактора Xа(триада активного центра - His236,Asp282 и Ser379). Молекула фактора Xа остается ассоциированной с комплексом через N- концевой Гла –домен легкой цепи.

Моделирование структуры комплекса TФ/VIIa/Xa с помощью докинга (анализа комплементарности третичных структур) и сайт-направленного мутагенеза, показало, что фактор Xа имеет протяженную конформацию, подобную структуре фактора VIIa в комплексе TФ/VIIa. Во взаимодействии с TФ/VIIa участвуют все домены фактора Xа, в том числе аминокислотные остатки Glu51 и Asn57 первого домена EGF, Asp92 и Asp95 второго EGF домена и Asp185a, Lys186, и Lys134 каталитического домена фактора Xа.

N-конец каталитического домена ориентирован таким образом, что может осуществляться как активация фактором Xа фактора VII,связанного с тканевым фактором, так и активация фактором VIIa профермента - фактора X.

Следует подчеркнуть, что комплекс ТФ/VIIa имеет чрезвычайно узкую субстратную специфичность, активируя ограниченным протеолизом только факторы X и IX.

Вначале образуется небольшое количество (пкМ) фактора Xa, который не только активирует фактор VII, связанный с тканевым фактором, но также стимулирует появление следовых (нМ) концентраций тромбина, достаточных для активации кофакторов - факторов V и VIII - в активные формы (факторы Va и VIIIa), а так же для активации рецептора PAR1 тромбоцитов, эндотелия и активации антикоагулянтной системы протеина С благодаря связыванию с рецептором- тромбомодулином эндотелия. Эта медленная фаза инициации свертывания (РИС 5).

Вслед за стадией инициации следует быстрая фаза распространения свертывания. Комплекс фактор TФ/VIIa активирует фактор IX в протеиназу – фактор IXа.

Фактор IX свертывания крови - зависимый от витамина К, одноцепочечный, гликозилированный мультидоменный белок (415 а.о.), содержит N-концевой Гла-домен, содержащий 12 остатков g-карбоксиглутаминовой кислоты, гидрофобный стек, два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF-домены), и каталитический протеазный домен(Рис).

Отщепление пептида активации в результате последовательного гидролиза двух связей Arg145-Ala146 и Arg180-Ile181 комплексом ТФ/VIIa приводит к формированию сериновой протеиназы - фактора IXа, с триадой активного центра (His221,Asp269 и Ser365).

Фактор IXа, связанный с фосфолипидами мембраны клетки и ионами Са образует с фактором VIIIa комплекс, называемый тенназой. В структуре фактора IXа локализован мотив основных аминокислотных остатков, среди которых Arg333 играет ключевую роль в связывании фактора IXа с фактором VIIIа. Активационный комплекс тенназа превращает фактор X в протеазу – фактор Xа с каталитической эффективностью, превосходящей более чем в 10⁵ раз эффективность одной протеиназы.

На поверхности мембраны клетки в присутствии ионов кальция фактор Xa образует комплекс с фактором Va, называемый протромбиназой. Этот комплекс, также как тенназа, в 10⁵ -10⁶ раз более активен, чем входящяя в него сериновая протеиназа - фактор Xa.

В структуре фактора Xa локализованы участки высокоаффинного связывания с фактором Va. Это прежде всего N-концевой Гла-домен легкой цепи фактора Xa, а также экспонированный на поверхность участок петли гепарин-связывающего экзосайта с кластером основных аминокислотных остатков. Мутации в структуре положительно заряженной петли фактора Xa по остаткам Arg165 (соответствующего Arg333 в структуре фактора IXa) и Lys 169 снижают сродство фермента к фактору Va в 4-7 раз. Это свидетельствует о ключевой роли этих основных остатков в узнавании ферментом -фактором Xa, своего кофактора, фактора Va, а фактором IXa - кофактора, фактора VIIIa.

Тромбин, который генерируется из протромбина под действием протромбиназы, усиливает свое собственное образование по механизму положительной обратной связи, активируя фактор XI в протеазу – фактор XIа, в свою очередь активирующий фактор IX.

Врожденная недостаточность фактора IX и его кофактора VIII фактора(вследствие дефектов структуры их генов (Табл.4)) ассоциируется с гемофилиями В и А соответственно. Если бы гемостаз осуществлялся через прямую активацию фактора X комплексом тканевой фактор – факторVIIa, то участие фактора IX не было бы столь необходимым и его недостаточность не приводила бы к гемофилии. Гемофилия А, наследуемая по сцепленному с X-хромосомой типу, встречается с частотой 1,3-1,8 на 10000 мужчин, а гемофилия В (ген фактора IX также локализован в X-хромосоме) – в 4 раза реже. Описано более 600 различных мутаций в генах факторов VIII и IX. Оба типа гемофилий- заболевания, связанные с полом. Если мужчина – гемофилик (с одной аномальной X-хромосомой) и здоровая женщина (с двумя нормальными X-хромосомами) имеют детей, то все дочери будут носителями дефектной хромосомы, а сыновья будут здоровыми. Женщины -носители гена гемофилии не имеют тенденции к кровоточивости,поскольку наследуют нормальный аллельный ген от матери, обеспечивающий 50% активности FVIII от нормы. Но если женщина –носитель гена гемофилии имеет детей от здорового мужчины, ее сыновья имеют шанс унаследовать гемофилию в 50% случаев, а дочери, так же в 50% случаев, могут быть носителями гемофилии. Около 1/3 больных гемофилией не имеют семейного происхождения заболевания. Эти спародические случаи возникают вследствие новых мутаций в Х- хромосоме, несущей гены факторов VIII и IX.

Доказательством важной роли внешнего пути для осуществления свертывания крови было открытие ингибитора TFPI(ингибитора пути тканевого фактора) (Рис 5, Таблица 4). TFPI принадлежит к семейству трехглавых ингибиторов Кунитца и состоит из тандема трех доменов Кунитца (К1, К2 и К3), из которых первый (К1) ингибирует фактор VIIa, связанный с тканевым фактором, а второй (К2) – фактор Xa. Третий домен не имеет ингибиторной активности к протеазам, но в его структуре (прежде всего в положительно заряженной С–концевой последовательности молекулы TFPI) локализован участок связывания протеогликанов эндотелия, таких как синдеканы и глипиканы. TFPI специфично связывается с тромбоспондином-1 тромбоцитов.

Этот ингибитор обнаружен в плазме в относительно низкой концентрации, а также в эндотелии сосудов и тромбоцитах. Когда тканевой фактор появляется на поверхности активированных клеток, TFPI ингибирует инициирование каскада свертывания следующим механизмом. Сначала TFPI с высоким сродством связывает фактор Xa и образует с ним комплекс (через второй домен), затем связывается (через С-конец третьего домена) с отрицательно заряженными протеогликанами мембраны клеток. Повышается локальная концентрация ингибитора. Затем TFPI связывает фактор VIIa и инактивирует комплекс TФ/VIIa. Таким механизмом контролируется и ограничивается образование фактора Xa. Поэтому для появления эффективных концентраций фактора Xa в условиях in vivo (достаточных для генерации относительно высоких концентраций тромбина и свертывания фибриногена) необходима генерация наряду с комплексом фактор VIIа - тканевой фактор также комплекса фактора IXa с фактором VIIIa.

TFPI блокирует способность TФ/VIIa активировать фактор X и клетки через рецепторы, активируемые протеиназами.

Тройной комплекс ТФ/VIIa/X активирует PAR 1 и 2 на клетках. Присоединение фактор Xа к комплексу TФ/VIIa повышает в 5 раз интенсивность клеточного ответа по сравнению с действием одного фактора Xа (см. глава 5). Тканевой фактор активирует клетки протеолитическим механизмом, зависимым от фактора VIIa свертывания крови, в котором тканевый фактор работает как кофактор и модулятор фактора VIIa. Связывание фактора VIIа с тканевым фактором стимулирует передачу запуск внутриклеточной сигнализации, приводя к повышению внутриклеточного Ca²⁺, фосфорилированию активируемых митогеном протеинкиназ, транскрипционных факторов и, в конечном счете, к синтезу и экспонированию адгезивных белков, ответственных за адгезию и миграцию клеток.

Итак, процесс свертывания поддерживается активацией фактора IX. Факторы IXa и Xa проявляют свою активность при ассоциации с неферментативными кофакторами-факторами VIIIa и Va, соответственно (Таблица 4). Факторы V и VIII -большие гликопротеиды, которые активируются протеолизом определенных связей фактором Xa или тромбином. Активные кофакторы - Va и VIIIa, состоят из субединиц, стабилизированных Са²⁺, и связываются с отрицательно заряженными фосфолипидами мембран, протеиназами- факторами Xa и IXa, и субстратами этих ферментов – протромбином и фактором X.

Протромбиназный комплекс (факторы Ха,Va,Са2+и фосфолипиды мембран) превращает протромбин в тромбин. В стехиометрическом комплексе фермента- фактора Xa и кофактора- Va происходят конформационные изменения в активном центре фактора Xа,облегчая взаимодействие фермента с субстратом-протромбином. Протромбин,связываясь с фактором Va и Xa, также претерпевает изменения, обеспечивающие эффективное взаимодействие между ферментом-фактором Xa и субстратом. Скорость реакции возрастает более чем на 5 порядков. Это увеличение происходит как за счет повышения сродства фермента к субстрату (снижения каталитической константы- Km), так и за счет повышения скорости реакции (возрастания каталитической константы-kcat).