Главная Случайная страница Контакты | Мы поможем в написании вашей работы! | ||
|
1. Определение понятия о микробах. Понятие о виде микробов. Основные принципы классификации микроорганизмов. Критерии и признаки, используемые при классификации. Нумерическая таксономия.
Микроорганизмы — это невидимые простым глазом представители всех царств жизни: эукариоты, прокариоты (эубактерии и архебактерии), вирусы и плазмиды. Они занимают низшие ступени эволюции, но играют важную и разнообразную роль в общей экономике природы, в круговороте веществ, в патологии человека, животных и растений.
Вид — группа или совокупность близких между собой организмов, которые имеют общий корень происхождения, на данном этапе эволюции характеризуются определенными морфологическими, биохимическими и физиологическими признаками, обособлены отбором от других видов и приспособлены к определенной среде обитания.
Специфические особенности микроорганизмов определили и набор тех признаков и свойств, которые используются для их систематики и классификации.
-Морфологические признаки — величина, форма, характер взаиморасположения.
-Тинкториальные свойства — способность окрашиваться различными красителями. Особенно важным признаком является отношение к окраске по Граму, которое зависит от структуры и химического состава клеточной стенки бактерий. По этому признаку все бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные Морфологические свойства и отношение к окраске по Граму определяют принадлежность к крупным таксонам — роду, семейству и т. д.
-Культуральные свойства — особенности роста бактерий на жидких (образование пленки, осадок, помутнение) и плотных (форма, размеры, консистенция, края, поверхность, прозрачность колоний, образование пигмента и другие свойства) питательных средах. В микробиологии широко используют такие специфические термины, как «колония», «культура», «штамм», «типы» или «варианты». Под колонией принято понимать видимую простым глазом изолированную структуру, образующуюся в результате размножения и накопления бактерий за определенный срок инкубации. Колония образуется обычно из одной родительской клетки или из нескольких идентичных клеток. Поэтому пересевом из изолированной колонии может быть получена чистая культура возбудителя. Под культурой понимают всю совокупность бактерий, выросших на плотной или жидкой питательной среде. Как колония, так и культура каждого вида характеризуются определенными признаками. Основной и главный принцип бактериологии — во избежание ошибок изучать свойства только чистых, однородных культур. Каждая выделенная культура данного вида бактерий называется также штаммом, т. е. конкретным образцом данного вида. Штаммы одного и того же вида бактерий, различающиеся по антигенному строению, называют серотипа- ми (сероварами, серовариантами), по чувствительности к фагу — фаготипами (фагова- рами), по биохимическим или культуральным признакам — биотипами (биоварами) и т. п. Штамм можно считать низшей таксономической единицей бактерий.
-Подвижность бактерий. Различают бактерии подвижные и неподвижные. Подвижные бактерии подразделяют на ползающие, или скользящие, они передвигаются за счет волнообразного сокращения клеток; и плавающие бактерии, у которых активная подвижность связана с наличием жгутиков.
-Спорообразование — форма и характер расположения споры в клетке.
-Физиологические свойства — способы углеродного (аутотрофы, гетеротрофы), азотного (аминоавтотрофы, аминогетеротрофы) питания; тип дыхания: аэробы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы, микроаэрофилы.
-Биохимические свойства — способность ферментировать различные углеводы, протеолитическая активность, образование индола, сероводорода, наличие уреазы и других ферментов и т. д.
-Чувствительность к специфическим бактериофагам.
-Антигенные свойства. Они зависят от химического состава клеточной стенки и жгутиков бактерий.
-Химический состав клеточных стенок (содержание и состав основных Сахаров и аминокислот).
-Липидный и жирнокислотный состав. Изучение состава жирных кислот проводят с помощью газовой хроматографии, которая обладает высокой разделительной способностью и чувствительностью.
-Белковые спектры. С помощью различных методов фракционирования, а главным образом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле, разделяют сложные смеси рибосомных, мембранных или внутриклеточных белков и получают электрофореграммы, или белковые спектры, соответствующей фракции данного вида бактерий.
В связи с тем, что количество фенотипических признаков, используемых для классификации микроорганизмов, значительно возросло, в конце 50-х гг. XX в. возникла нумерическая (численная) таксономия.
Ее возникновению способствовало появление более совершенных компьютерных систем, которые позволяют быстро и точно производить громоздкие математические расчеты. В основе нумерической таксономии лежит принцип сопоставления организмов по возможно большему количеству учитываемых признаков при допущении, что все они для систематики равноценны. Однако принцип равнозначности является основным недостатком этого метода.
2. Специальные методы микроскопии: люминесцентная, фазовоконтрастная, темнопольная. Понятие об электронной микроскопии. Принципы устройства и работы электронного микроскопа.
Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции.
Люминесценция — свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо источников энергии: световых, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция — люминесценция объекта под влиянием света. Если освещать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта.
Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе.
Фазовоконтрастная микроскопия. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным — светлое изображение объекта на темном фоне.
Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители.
Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.
Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового, в котором все оптические элементы заменены соответствующими электрическими: источник света — источником электронов, стеклянные линзы — линзами электромагнитными. В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, вакуумную, электропитания. Фотографирование изображений при всех видах исследований проводится на фотопластинки или фотопленку. Источником электронов является электронная пушка, состоящая из v образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900 °С при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом. Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроноплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое полезное увеличение объекта.
После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца. Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцирующий экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование. Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.
3. Строение бактериальной клетки. Функции клеточной стенки. Структура клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Пептидогликан, липополисахарид, липопротеин, внешняя мембрана, их структура, функции.
Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядра, называемого нуклеоидом. Имеются дополнительные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать споры.
Функции клеточной стенки:
1. Определяет и сохраняет постоянную форму клетки.
2. Защищает клетку от механических и осмотических сил внешней среды.
3. Участвует в регуляции роста и деления клеток.
4. Обеспечивает коммуникацию с внешней средой через каналы и поры.
5. Несет на себе специфические рецепторы для бактериофагов.
6. Определяет во многом антигенную характеристику бактерий (природу и специфичность О- и К-антигенов).
7. Содержащийся в ее составе пептидогликан наделяет клетку важными иммунобиологическими свойствами.
8. Нарушение синтеза клеточной стенки бактерий является главной причиной их L-трансформации.
Метод выявления клеточной стенки - электронная микроскопия, плазмолиз.
Особенности клеточной стенки грамотрицательных бактерий
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий значительно тоньше, и у большинства из них ее толщина составляет 14—18 нм. Четко выделяются два слоя - наружный — пластичный и внутренний — ригидный. Основная особенность клеточной стенки грамотрицательных бактерий: ригидный слой тонкий, представлен одним слоем пептидогликана, на долю которого приходится до 5—10 % сухого веса стенки. Для пептидогликана характерно низкое содержание поперечных сшивок между пептидными цепочками, однако в нем почти всегда имеется диаминопимелиновая кислота.
В составе клеточной стенки содержится много липопротеинов, фосфолипидов, липополисахарид, больше белка и, как правило, отсутствуют тейхоевые кислоты. Пластичный слой клеточной стенки у грамотрицательных бактерий представляет собой сложную мозаику, образованную из липопротеинов, липополисахаридов и наружной мембраны.
-Пептидогликан включает в себя остов и два набора пептидных цепочек — боковых и поперечных. Остов пептидогликана одинаков у всех бактерий и состоит из чередующихся молекул аминосахаров — N-ацетилглюкозамина (N-АцГлю) и
N-ацетилмураминовой кислоты (N-АцМур), связанных между собой b-гликозидными связями. Боковые цепочки в каждой молекуле пептидогликана представлены набором идентичных тетрапептидов. Поперечные цепочки также представлены набором из идентичных для данной молекулы пептидогликана пентапептидов, содержащих глицин, — пентаглицинов, однако у разных видов бактерий боковые и поперечные пептиды различны. В тетрапептидной боковой цепочке у большинства грамотрицательных бактерий имеется диаминопимелиновая (диаминопимеловая) кислота (ДАП) — уникальный компонент клеточной стенки, обнаруженный только у прокариот. Кроме того, в составе боковых цепочек пептидогликана обнаружены О-аминокислоты (Б-аланин, Б-глутамин). Боковые тетрапептиды связаны с М-ацетилмураминовой кислотой остова. Связывание боковых тетрапептидов между собой происходит путем образования поперечных пентаглициновых мостиков между D-аланином одной цепи и диаминопимелиновой кислотой (или иной аминокислотой) другого бокового пептида. Наличие двух типов связей (гликозидные и пептидные), которые соединяют субъединицы пептидогликанов, придает этому гетерополимеру структуру молекулярной сети. Благодаря этим связям пептидогликановый слой клеточной стенки образует огромного размера ригидную мешковидную макромолекулу, которая окружает протопласт, уравновешивает его тургорное давление (у Е. соli — до 15 атм.) и придает ему определенную постоянную форму. Пептидогликан может разрушаться под действием различных ферментов, а его синтез блокируют бета-лактамные антибиотики.
-Липопротеины связывают наружную мембрану с пептидогликаном (белок связан с диаминопимелиновой кислотой бокового тетрапептида, а липид — нековалент- но с наружной мембраной).
-Липополисахарид (ЛПС) состоит из комплекса липида А и связанного с ним полисахарида, состоящего из ядра, которое одинаково у всех грамотрицательных бактерий, и терминальной цепочки из повторяющихся Сахаров (рис. 6). Последние у разных видов бактерий различаются по химической природе. Они обычно представлены линейными трисахаридами или разветвляющимися тетра- или пентасаха- ридами. Терминальные повторяющиеся единицы полисахарида ЛПС располагаются на поверхности клетки в виде микроворсинок и определяют ее антигенную специфичность. ЛПС синтезируется на цитоплазматической мембране, а затем транспортируется в наружную часть клетки, он прикреплен к наружной мембране с помощью гидрофобных связей. ЛПС выполняет две важнейшие функции у грамотрицательных бактерий: во-первых, он определяет их антигенную специфичность, а во-вторых, является одним из главных факторов их патогенности. ЛПС — это эндотоксин. Его токсичность определяется липидом Кроме того, ЛПС в организме запускает синтез около 20 различных биологически активных соединений, которые опосредуют патогенез эндотоксикоза, и обладает пирогенным действием.
-Наружная мембрана, подобно любой биологической мембране, состоит из двух слоев липидов, но в ней значительная часть фосфолипидов наружного слоя замещена молекулами липополисахаридов и набором белков, локализованных мозаично (рис. 7). В состав этих белков, заключенных в фосфолипидную матрицу, входят 3 или 4 основных (тарт), которые составляют около 70 % суммарных белков наружной мембраны; липопротеины и второстепенные белки, числом более 10. Два из основных белков проходят через оба слоя мембраны и прочно связаны с пептидогликаном. Эти белки-порины располагаются в виде триплетов и образуют диффузионные поры, через которые в клетку проникают мелкие гидрофильные молекулы. Второстепенные белки выполняют разнообразные специфические функции: одни из них участвуют в облегченной диффузии, другие - в активном транспорте молекул через наружную мембрану и выступают в качестве специфических рецепторов для фагов и колицинов. Некоторые из этих белков участвуют в конъюгации (являются рецепторами для донорных ворсинок), в контроле репликации ДНК и регуляции клеточного деления. Наружная мембрана осуществляет также функцию барьера,
через который в клетку не способны проникать крупные молекулы (один из механизмов неспецифической устойчивости грамотрицательных бактерий к антибиотикам). Если бактерии поместить в гипертонический раствор, наступает резкое обезвоживание клеток, цитоплазма съеживается, и протопласт отходит от клеточной стенки. Это явление называется плазмолизом. В результате плазмолиза клетки гибнут. Этим свойством широко пользуются для консервирования пищевых продуктов с помощью концентрированных растворов поваренной соли или сахара.
4. L-формы бактерий, их особенности и роль в патологии человека. Факторы, способствующие образованию L-форм. Микоплазмы и заболевания, вызываемые ими.
Она может быть обратимой и необратимой. В случае если генетический контроль синтеза клеточной стенки сохраняется, L-формы при благоприятных условиях могут возвращаться в исходную бактериальную форму с восстановлением всех основных биологических свойств, включая патогенность. Если же генетический контроль синтеза клеточной стенки нарушен необратимо, трансформация приобретает необратимый характер, а такие L-трансформанты по своим морфологическим, культуральным и иным свойствам становятся неотличимыми от микоплазм. L-трансформация происходит как in vitro, так и in vitro (в организме человека и животных). Факторами, индуцирующими ее, являются различные антибиотики, угнетающие биосинтез клеnочной стенки (пенициллин, цефалоспорины, циклосерин, ванкомицин и т. п.); ферменты (лизоцим, амидаза, эндопептидаза); антимикробные антитела; высокие концентрации некоторых аминокислот, особенно глицина и фенилаланина.
Исключительное значение L-трансформации патогенных бактерий заключается в том, что она является частой причиной перехода острых форм заболеваний в хронические и их обострений. L-трансформацию надо рассматривать не просто как одно из проявлений изменчивости бактерий, а как своеобразную, присущую всем бактериям форму приспособления к неблагоприятным условиям существования (подобно спорообразованию), которая способствует сохранению вида бактерий в природе. Клеточная стенка и ее синтез чувствительны к действию антител и различных химиопрепаратов. Освобождение от нее не лишает бактерии жизнеспособности, но позволяет переживать действие этих неблагоприятных для них факторов, а по их устранении — возвращаться в свое исходное состояние.
Клеточная стенка — сложный структурный элемент, встречающийся только у эубактерий (кроме микоплазм) и характеризующийся наличием в его составе уникального химического соединения — пептидогликана, наделяющего клетку важными иммунобиологигескими свойствами и определяющего ее постоянную форму;
Микоплазмы различные по форме бактериальные клетки (мелкие шары, короткие нити), лишенные клеточной стенки, имеющие небольшие размеры (125-250 нм).
Микоплазмы адсорбируются на поверхности клеток хозяина и внедряются в нее.
Вирусы урогенитальных и респираторных заболеваний могут располагаться на мембранах микоплазм, обитающих в мочеполовой или дыхательной системах.
Классификация микоплазм
Микоплазмы относятся к семейству Mycoplasmataceal. Это семейство разделяется на 2 рода:
Род Mycoplasma включает около 100 видов.
Основные 4 вида:
Mycoplasma hominis
Mycoplasma genitalium
Mycoplasma species
Mycoplasma pneumonia
Род Ureaplasma (2 вида)
ureaplasma urealiticum
ureaplasma parvum
Ныне известно 6 видов микоплазм, вызывающих болезни человека: Mycoplasma pneumonia, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma species, Ureaplasma urealticum, Mycoplasma incognita(выделена у больных СПИДом).
В настоящее время количество заболеваний, вызванных микоплазмами, существенно увеличилось.
Микоплазма гениталиум (Mycoplasmagenitalium) обладает наиболее выраженным патогенным потенциалом.
С помощью специальной структуры (органеллы) клетки микоплазмы прикрепляются к эритроцитам и другим клеткам.
Микоплазма хоминис (Mycoplasmahominis) является менее патогенной, но встречается значительно чаще при инфекционных процессах мочеполовой системы. Mycoplasmahominis значительно чаще обнаруживается при воспалительных процессах у женщин, чем у мужчин.
Микоплазма пневмония (Mycoplasmapneumoniae) возбудитель первичной атипичной пневмонии человека служит причиной внутриутробной инфекции.
Микоплазмозы классифицируются по локализации (микоплазменный уретрит, простатит, цервицит, эндометрит, сальпингит и т.д.)
Мочеполовые микоплазменные инфекции могут быть острыми, хроническими и бессимптомными.
Обычно малосимптомные вульвовагиниты, уретриты, цервициты переходят в хроническую форму мочеполового микоплазмоза (например, воспалительные процессы в маточных трубах, яичниках, негонококковые уретриты).
Больные жалуются на: зуд в области мочеполовых органов, незначительные слизистые выделения, которые могут и исчезать, а спустя некоторое время вновь появляться и усиливаться.
Острый урогенитальный микоплазмоз наблюдается редко. При правильном лечении пациент полностью выздоравливает.
У мужчин: микоплазмозы вызывают поражение мочеиспускательного канала, предстательной железы, семенных пузырьков, придатков яичек, мочевого пузыря, почек и мочевыводящих путей.
При мужском бесплодии целесообразно исследовать сперму микробиологическим методом (бактериальный посев) на микоплазму и уреаплазму.
У женщин: женщины наиболее часто являются бессимптомными носителями микоплазм.
Под воздействием стрессовых факторов скрытая инфекция может перейти в хроническую или острую инфекцию.
5. Строение бактериальной клетки. Цитоплазматическая мембрана, ее структура и основные функции. Роль мембраны в процессах мобилизации энергии, механизм энергизации мембраны.
Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядра, называемого нуклеоидом. Имеются дополнительные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать споры.
ЦМ содержит фосфолипиды, образующие два слоя, белки и углеводы. Молекулы фосфолипидов асимметричны: головки, несущие электрический заряд, гидрофильны; хвостики — нейтральны и гидрофобны. Фосфолипиды упакованы в мембране следующим образом: их полярные гидрофильные головки обращены наружу и образуют два слоя ЦМ — внутренний и внешний, а неполярные гидрофобные хвостики скрыты в толще мембраны. На электронограммах ЦМ имеет вид трехслойной структуры, состоящей из двух параллельных темных слоев и разделяющего их светлого слоя. Этот слой более проницаем для электронов, чем слои, состоящие из полярных концов фосфолипидов, ассоциированных с белками. Специфичность функций ЦМ во многом зависит от набора содержащихся в них белков.
Структура, состоящая из клеточной стенки и ЦМ, получила название оболочки клетки.
Цитоплазматическая мембрана (ЦМ) является исключительно полифункциональной структурой.
1. ЦМ воспринимает всю химическую информацию, поступающую в клетку из внешней среды.
2. Она является основным осмотическим барьером, благодаря которому внутри клетки поддерживается определенное осмотическое давление.
3. ЦМ совместно с клеточной стенкой участвует в регуляции роста и клеточного деления бактерий.
4. ЦМ участвует в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид (они связаны с ее рецепторами).
5. В ЦМ содержится значительное количество ферментов, в том числе системы переноса электронов (ЦМ — место генерации энергии у бактерий).
6. С ЦМ связаны жгутики и аппарат регуляции их движения.
7. ЦМ участвует в процессах транспорта (в том числе активного) питательных веществ в клетку и продуктов жизнедеятельности, включая ферменты и экзотоксины, из клетки в окружающую среду. В ней содержатся белки, участвующие в облегченной диффузии и активном транспорте.
8. ЦМ участвует в синтезе компонентов клеточной стенки и образовании мезосом (мезосомы возникают в результате инвагинации участка ЦМ в цитоплазму, они открыты в периплазматическое пространство).
9. ЦМ играет важную роль в компартментализации, т. е. в разделении на «отсеки» рибосом и их стабилизации.
6. Рибосомный аппарат бактериальной клетки, его функции. Структура рибосмы. Содержание рибосом в клетке. Сущность процессов транскрипции и трансляции.
Основным компонентом белоксинтезирующей системы является рибосома. Она объединяет все компоненты в единый комплекс. Рибосомы — «святая святых» клетки.
так как именно на них совершается самое удивительное таинство живой материи — биологический синтез белка. Информация, содержащаяся в геноме, расшифровывается и материализуется в виде белков на рибосомах. Без них проявление жизнедеятельности невозможно.
Вирусы и плазмиды потому и являются облигатными внутриклеточными паразитами, что у них отсутствуют собственные рибосомы, и для реализации генетической информации (т. е. для проявления своей жизнедеятельности) они используют рибосомный аппарат клетки-хозяина.
Процесс синтеза белка складывается из двух основных этапов: транскрипции и трансляции.
Транскрипция- или переписывания информации с ДНК-гена на мРНК-ген. Транскрипция осуществляется с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы.
Трансляция — процесс расшифровки генетического кода в мРНК и овеществление его в виде полипептидной цепи, последовательность расположения аминокислот в которой определяется порядком расположения кодонов в данной мРНК. Трансляция, таким образом, — это процесс собственно биосинтеза белка на рибосомах. Он состоит из следующих основных этапов:
1. Инициации (начала) трансляции.
2. Элонгации, или удлинения полипептидной цепи (собственно трансляция).
3. Терминации (окончания) трансляции.
4. Модификации полипептидной цепи.
Каждый из этих этапов представляет собой сложный многоступенчатый процесс и находится под жестким контролем, осуществляемым прежде всего компонентами самой белоксинтезирующей системы.
7. Споры бактерий. Образование и структура споры, ее прорастание. Генетический контроль спорообразования.
Некоторые роды бактерий (Васilus, Сlоstridiuт, Sporosarcina) при неблагоприятных для их существования условиях образуют защитные формы — эндоспоры. Споры представляют собой своеобразные покоящиеся клетки; у них чрезвычайно низкая метаболическая активность, но они обладают высокой устойчивостью к высушиванию, действию повышенной температуры и различных химических веществ. Высокую резистентность спор к действию указанных факторов связывают с присутствием в оболочке большого количества кальциевой соли дипиколиновой кислоты. Споры сильно преломляют свет, поэтому они хорошо заметны в неокрашенных препаратах.
В процессе спорообразования (споруляции) бактериальная клетка подвергается сложной перестройке. Вначале на одном из ее полюсов происходит конденсация нуклеоида и отделение его за счет образования септы. Затем ЦМ начинает обрастать образовавшийся протопласт споры и возникает складка, состоящая из двух слоев ЦМ, позднее они сливаются, в результате образовавшаяся предспора оказывается окруженной двойной оболочкой. На следующей стадии между двумя мембранами, покрывающими предспору, формируется толстый слой кортекса (коры). Самый внутренний слой его представляет собой зародышевую стенку (из него образуется клеточная стенка прорастающей вегетативной клетки). По мере созревания споры обе ее мембраны участвуют в образовании специальных слоев споры. Таким образом между обращенными друг к другу мембранами образуются зародышевая стенка, кортекс, а также расположенные снаружи от мембран наружная и внутренняя оболочки и экзоспорий. Сформировавшаяся эндоспора состоит из протопласта с нуклеоидом, стенки споры, кортекса, оболочки и экзоспория.
-Протопласт споры (ядро) содержит ЦМ, цитоплазму, хромосому, все компоненты белоксинтезирующей системы и анаэробной энергообразующей системы.
-Стенка споры непосредственно окружает внутреннюю мембрану ее и представлена пептидогликаном, из которого формируется клеточная стенка прорастающей клетки.
-Кортекс — самый толстый слой оболочки споры. Он состоит из пептидогликана, содержащего мало поперечных сшивок и поэтому очень чувствительного к лизоциму. Разрушение кортекса лизоцимом играет пусковую роль в процессе прорастания споры.
-Оболочка споры построена из кератиноподобного белка. Плохая проницаемость ее определяет высокую устойчивость спор к действию различных химических веществ.
-Экзоспорий — липопротеиновая оболочка, содержащая немного углеводов. После завершения спорообразования вегетативная часть клетки отмирает, спора высвобождается и длительное время сохраняется в окружающей среде, до тех пор, пока не возникнут условия, благоприятные для ее прорастания.
Генетигеский контроль спорообразования
Процесс спорообразования контролируется более чем 40 оперонами, которые представляют собой как бы дополнительный геном у спорообразующих бактерий. В составе этого генома насчитывается более 60 генов. Инициация споруляции связана с геном sроО, мутации в котором делают невозможным образование споры с самых начальных стадий. Транскрипция гена sроО запускает последовательную транскрипцию всех оперонов спорового генома. При этом их транскрипция носит строго регулируемый характер: выражение более поздних генов зависит от транскрипции более ранних генов. Это обусловливает четкую временную последовательность биохимических и морфологических процессов, лежащих в основе споруляции. Спорообразующие бактерии обладают механизмами, с помощью которых они распознают определенные изменения в окружающей среде, например, уменьшение содержания источников энергии, некоторых аминокислот и оснований. В ответ на это в клетке происходят метаболические изменения, которые и запускают споруляцию.
Прорастание споры происходит после получения соответствующего химического сигнала. Различные виды спорообразующих бактерий располагают рецепторами, распознающими наличие в среде источников энергии, L-аланина, аденозина и других веществ. Связывание с такими эффекторами активирует содержащийся в споре автолизин (лизоцим), который быстро разрушает пептидогликан кортекса.
Прорастание спор включает три стадии: активацию, начальную стадию и стадию роста.
ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ
1. Размножение микробов. Механизмы деления бактериальной клетки. Методы культивирования микробов: стационарный, глубинный с аэрацией, проточный. Периодические, непрерывные и синхронные культуры. Фазы роста периодической культуры.
В условиях скоординированного роста деление клетки происходит, когда она удваивает свою биомассу, строго посередине. Процесс деления клетки сопряжен с процессом сегрегации (распределения) дочерних хромосом и дочерних плазмид в дочерние клетки. У бактерий обнаружены белки- гомологи белков РаrА и РаrВ (они осуществляют равномерное распределение плазмид между дочерними клетками) и белок МuсВ. Вместе с белками мембраны они образуют комплекс, растаскивающий хромосомы в дочерние клетки перед образованием межклеточной перегородки. Связь между вегетативной репликацией хромосомы и клеточным делением включает три следующих последовательных события:
1. подготовку к инициации репликации;
2. цикл репликации хромосомы (и плазмиды);
3. интервал времени между завершением репликации хромосомы и клеточным делением. Клеточный цикл бактерий можно выразить следующей формулой:
Т = С + Э,
где Т — время удвоения; С — время цикла репликации; Б — время между завершением цикла репликации и клеточным делением.
При благоприятных условиях роста Т для Е. соli и многих других бактерий составляет около 30 мин. Деление бактериальной клетки находится также под строгим генетическим контролем, нарушение которого приводит и к нарушению механизма клеточного деления.
Деление бактерий наступает в результате формирования межклеточной перегородки, которое происходит следующим образом. В том участке ЦМ, с которым связана с помощью особого рецептора молекула ДНК (хромосома, плазмида), происходят события, инициирующие процесс репликации, в результате которого вновь образующаяся дочерняя молекула ДНК прикрепляется также к рецептору на ЦМ. Область последней между двумя рецепторами, к одному из которых прикреплена родительская, а к другому — дочерняя ДНК, начинает удлиняться, в результате этого расстояние между ними увеличивается в течение времени С. По завершении процесса репликации строго по экватору между отделившимися друг от друга хромосомами начинает формироваться межклеточная перегородка путем встречной инвагинации (врастания навстречу друг к другу) ЦМ и связанной с ней области клеточной стенки.
В результате слияния инвагинирующих участков ЦМ и КС образуется межклеточная перегородка, и родительская клетка разделяется на две дочерние клетки равной длины. Функцию аппарата митоза у бактерий выполняет ЦМ путем своего удлинения, которое раздвигает хромосомы (и плазмиды) таким образом, что они оказываются по ту и другую стороны формирующейся межклеточной перегородки в равных соотношениях.
Для выращивания бактерий используют следующие способы их культивирования: стационарный, глубинный с аэрацией и с использованием проточных питательных сред.
1. Стационарный способ: питательные среды сохраняются постоянными, с ними никаких дополнительных манипуляций не производят. Однако при таком способе культивирования в жидких питательных средах, где преобладают анаэробные энергетические процессы, выход биомассы незначителен. Поэтому в связи с развитием микробиологической промышленности были разработаны принципиально новые способы культивирования, позволяющие получать гораздо больший выход биомассы или биологически активных соединений. К их числу относятся метод глубинного культивирования с аэрацией и метод использования проточных сред.
2. Метод глубинного культивирования с аэрацией. Для выращивания с помощью этого способа применяют специальные устройства — реакторы. Они представляют собой герметические котлы (приспособленные автоклавы), в которые заливается жидкая питательная среда. Реакторы снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальные рН и гН2, дозированное поступление необходимых дополнительных питательных веществ. Однако главная особенность таких реакторов в том, что они постоянно продуваются стерильным воздухом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда постоянно перемешивается. Поэтому во всей питательной среде создается такая концентрация свободного кислорода, при которой энергетические процессы происходят в аэробных условиях, т. е. достигается максимальное использование энергии, заключенной в глюкозе, а следовательно, и максимальный выход биомассы. Для примера: выход биомассы при стационарном методе культивирования Е. соli в МПБ через 18—20 ч составляет 1—2 млрд клеток на 1 мл среды, а при глубинном методе через 12-14 ч - 50-60 млрд клеток/мл среды.
3. Использование проточных питательных сред позволяет создать условия, при которых клетки имеют возможность длительное время находиться в определенной фазе роста (экспоненциальной) при постоянной концентрации питательных веществ и в одних и тех же условиях, обеспечивающих непрерывный рост культуры. Методы получения непрерывных культур основаны на том, что в аппарат, где растут клетки, непрерывно добавляют свежую питательную среду и одновременно из него удаляют соответствующее количество бактерий.
Таким образом, в соответствии со способами культивирования различают:
1) периодические (при стационарном и глубинном методах культивирования) и
2) непрерывные (при проточном способе) культуры микроорганизмов.
3) синхронные культуры, в которых все клетки одновременно (синхронно) делятся. Однако такая синхронность сохраняется, как правило, в течение 2—3 циклов деления, а затем она нарушается. Синхронные культуры используют в основном для изучения тех или иных стадий клеточного цикла бактерий и роли отдельных генов (и их продуктов) в их осуществлении.
2. Искусственные питательные среды, применяемые для выращивания микробов. Требования, предъявляемые к питательным средам. Дифференциально-диагностические среды, принципы их конструирования. Состав сред Эндо и Плоскирева.
Они могут выть жидкими, твердыми (лучше называть их плотными) или полужидкими. Жидкие cреды готовят на основе водных растворов каких-либо веществ, чаще всего мясной воды, различных гидролизатов, иногда жидких естественных продуктов (молока, крови и др.). Для получения плотных сред к ним добавляют или агар, или желатин, или силикагель в соответствующих концентрациях. По происхождению среды делят на естественные (кровяные, молочные, картофельные, яичные) и искусственные, получившие особенно широкое распространение.
Питательные среды должны обязательно отвечать трем основным требованиям:
1. они должны содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества (источники энергии, углерода, азота), соли и ростовые факторы;
2. должны иметь оптимальную для роста данного вида бактерий рН;
3. должны иметь достаточную влажность (при их усыхании повышается концентрация питательных веществ, особенно солей, до уровней, тормозящих рост бактерий).
-Дифференциально-диагностические — среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям. К ним относятся среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса и многие др.
-Среда Эндо. Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью.
-Среда Плоскирева.
В состав среды входят: 53,6% сухого питательного агара с желчными солями, 14,4% лимоннокислого натрия, 11% гипосульфита, 12% лактозы, 3,7% фосфорнокислого натрия, 0,03—0,06% нейтрального красного, 0,002 бриллиантового зеленого, 1,2% соды кальцинированной, 0,04% йода, 3,7% NaCl.
3. Питание микробов. Типы питания. Источники углерода, азота и энергии. Механизм питания бактерий, диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт. Пермеазные системы, их состав, этапы активного транспорта.
Большинство бактерий живет в среде, мало подходящей для того, чтобы поддерживать строгое соотношение воды, солей и органических веществ, без которого невозможна жизнь. Это обусловливает необходимость постоянного и тщательного регулирования обмена различными веществами, который происходит между клеткой и внешней средой и контролируется клеточной мембраной. Она проницаема для многих веществ, поток их идет в обоих направлениях (из клетки и в клетку), но структура мембраны такова, что она обладает избирательной и неравномерной проницаемостью, определяющей механизмы питания бактерий.
Типы питания. К числу важнейших химических элементов-органогенов, необходимых для синтеза органических соединений, относят: углерод, азот, водород и кислород. Свою потребность в водороде и кислороде бактерии удовлетворяют за счет воды. Сложнее обстоит дело с углеродным и азотным питанием. По способу углеродного питания бактерии делят на аутотрофы и гетеротрофы.
-Аутотрофы— организмы, которые полностью удовлетворяют свои потребности в углероде за счет С02.
-Гетеротрофы— организмы, которые не могут удовлетворить свои потребности в углероде только за счет С02, а требуют для питания готовых органических соединений. В свою очередь, гетеротрофов подразделяют на сапрофитов, т. е. гетеротрофов, источником питания которых служат мертвые органические субстраты; и паразитов т. е. гетеротрофов, живущих за счет живых тканей животных и растений. Для превращения С02 в органические соединения требуется энергия. Существует два источника этой энергии - фотосинтез и хемосинтез.
-Фотосинтез — это синтез за счет энергии солнечного света.
-Хемотаксис — грамотрицательные бактерии используют для своего роста энергию хемосинтеза, т. е. энергию, получаемую за счет окисления неорганических соединений.
Питательные вещества из внешней среды поступают в бактериальную клетку с помощью трех основных механизмов: пассивной диффузии, облегченной диффузии и активного транспорта.
1. Пассивная диффузия осуществляется за счет различного содержания питательных веществ в среде и в клетке и происходит в направлении от большей концентрации к меньшей, т. е. по градиенту концентрации. Когда концентрация вещества по ту и другую сторону мембраны уравнивается, пассивная диффузия прекращается. Ее скорость зависит от величины градиента, но она имеет определенный предел. Таким путем в клетку проникает (и покидает ее) вода вместе с растворенными в ней различными мелкими молекулами, способными проходить через мелкие поры мембраны. Для пассивной диффузии характерно отсутствие субстратной специфичности, и она не требует затраты энергии.
2. Облегченная диффузия характеризуется выраженной субстратной специфичностью и протекает при обязательном участии специфических белков, локализованных в мембране; синтез некоторых из них индуцируется соответствующими субстратами. Эти белки, получившие название пермеаз, обладают субстратной специфичностью. Они распознают и связывают молекулу субстрата на внешней стороне мембраны и обеспечивают каким-то образом ее перенос через мембрану. На внутренней поверхности мембраны комплекс пермеаза—субстрат диссоциирует, освободившаяся молекула субстрата включается в общий метаболизм клетки, а пермеаза повторяет очередной цикл переноса своего субстрата, который не способен проникать через мембрану путем простой диффузии. Главное свойство пермеаз - способность проходить через мембрану как с присоединенной молекулой субстрата, так и без нее. Однако облегченная диффузия происходит только по градиенту концентрации, но не против него, поэтому она не требует затраты энергии. Пермеазы, присоединившись к субстрату, повышают его способность проникать через мембрану. Облегченная диффузия протекает со значительно более высокой скоростью, чем пассивная. Ее скорость подчиняется закону Михаэлиса-Ментен, и при достижении равновесия концентрация субстрата, доставляемого посредством облегченной диффузии, на внутренней и внешней поверхностях мембраны становится одинаковой.
3. Активный транспорт. С помощью механизмов активного транспорта растворенные вещества могут поступать в клетку против градиента концентрации, поэтому активный транспорт требует от клетки затраты энергии. У бактерий этот механизм питания является преобладающим. С его помощью они обеспечивают такие концентрации растворенных питательных веществ внутри клетки, которые могут во много раз превышать их концентрации во внешней среде и обеспечивают им высокие скорости метаболизма даже при низкой концентрации химических веществ в окружающей среде. У многих бактерий, в особенности грамотрицательных, в активном транспорте принимают участие особые связывающие белки, не идентичные пермеазам и не входящие в структуру мембраны, а локализованные в периплазматическом пространстве. У связывающих белков отсутствует каталитическая активность, но они обладают очень высоким сродством к определенным питательным веществам — к различным аминокислотам, сахарам, неорганическим ионам. Выделено и изучено более 100 различных связывающих белков, которые образуют прочные комплексы со своими субстратами и необходимы для их активного переноса через мембрану. Связывающие белки функционируют только в комплексе со специфическими пермеазами, осуществляющими активный перенос субстрата через мембрану. Метаболическая энергия, необходимая для этого, используется для снижения сродства пермеазы к своему субстрату на внутренней поверхности мембраны по сравнению с ее сродством к нему на внешней стороне мембраны. В результате этих превращений происходит изменение скорости выхода субстрата наружу, она становится во много раз меньше скорости его поступления в клетку. При этом механизме активного транспорта через мембрану в клетку поступают против градиента концентрации химически не измененные питательные вещества. У бактерий, вместе с тем, существуют и такие транспортные системы, которые переводят питательные вещества в химически измененную форму, не способную проникать через мембрану. К их числу относится фосфотрансферазная система, широко распространенная среди бактерий. С помощью этой системы транспортируются многие сахара и их производные, в процессе переноса они фосфорилируются и поступают в клетку в виде сахарофосфатов. Поскольку мембрана для последних непроницаема, сахарофосфаты остаются внутри клетки.
4. Дыхание микробов. Аэробы и анаэробы. Получение энергии в аэробных и анаэробных условиях. Облигатные и факультативные анаэробы. Причины высокой чувствительности анаэробов к молекулярному кислороду. Методы культивирования анаэробов.
По типу дыхания подразделяются на следующие четыре группы:
1. строгие аэробы (размножаются только в присутствии кислорода);
2. микроаэрофилы (нуждаются в уменьшенной концентрации свободного кислорода);
3. факультативные анаэробы (могут потреблять глюкозу и размножаться как в аэробных, так и в анаэробных условиях);
4. строгие анаэробы (размножаются только в бескислородных условиях, т. е. не используют 02 в качестве конечного акцептора электронов).
--Строгие анаэробы. Синтез АТФ при потреблении глюкозы в анаэробных условиях (гликолиз) происходит за счет фосфорили- рования субстрата. Из одной молекулы глюкозы в этих условиях образуются две молекулы молочной кислоты, а выход энергии составляет всего 20 ккал (синтезируются две молекулы АТФ) на моль глюкозы, т. е. во много раз меньше, чем при полном окислении этого основного носителя энергии. Хотя анаэробы также мобилизуют энергию в результате окислительно-восстановительных процессов, т. е. в результате переноса водорода (электронов), но кислород для них не служит конечным акцептором электронов. Более того, молекулярный кислород оказывает на них токсическое действие, причины которого следующие:
1. у анаэробных бактерий кислород угнетает анаэробные энергообразующие реакции (эффект Пастера);
2. у строгих анаэробов отсутствует фермент каталаза, поэтому накапливающаяся в присутствии кислорода Н202 оказывает на них бактерицидное действие;
3. у строгих анаэробов отсутствует система регуляции окислительно-восстановительного потенциала (редокс-потенциала)
--Различают облигатные (строгие, обязательные) и факультативные (необязательные) анаэробы. Облигатные анаэробы погибают при наличии свободного кислорода в окружающей среде. Факультативные анаэробы способны существовать и размножаться как в кислородной, так и в бескислородной среде. К факультативным анаэробам относятся кишечная палочка, иерсинии, стафилококки, стрептококки и шигеллы и др.
--Культивирование анаэробов. В связи с высокой чувствительностью строгих анаэробов к молекулярному кислороду для их культивирования с помощью различных способов создаются бескислородные условия. С этой целью используются механические, физические, химические и биологические способы удаления кислорода: посевы в глубокие столбики агара; кипячение (регенерация) жидкой питательной среды (Китта—Тароцци), содержащей глюкозу и кусочки печени (для связывания растворенного кислорода), и заливка ее стерильным вазелиновым маслом; добавление в атмосферу роста химических веществ, поглощающих кислород (например, щелочного пирогаллола); совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов на кровяном агаре с глюкозой в за- парафинированной чашке Петри (вначале растут строгие аэробы, а после снижения содержания кислорода — анаэробы) — способ Фортнера — и т. п. Наилучшим методом является применение специальных анаэростатов, из которых воздух откачивается и (или) замещается каким-либо инертным газом или смесью азота и углекислого газа.
5. Процессы брожения и гниения. Их значение для круговорота веществ в природе, а также для хозяйственной деятельности человека. Круговорот азота в природе и бактерии, участвующие в нем. Виды брожения.
Анаэробиоз — жизнедеятельность, протекающая при отсутствии свободного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называется брожением. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения.
Гниение, разложение сложных азотсодержащих органических соединений (преимущественно белков) под действием гнилостных микроорганизмов; т.к. при гниение выделяется преимущественно газообразный аммиак, гниение называется также аммонификацией, а микроорганизмы, участвующие в нём, — аммонификаторами. Гниение — сложный многоступенчатый биохимический процесс, направление которого и результат не постоянны и зависят от химической природы субстрата, от доступа кислорода и состава микрофлоры. На разных этапах гниение доминируют специфические группы микробов.
Среди гнилостных микроорганизмов ведущая роль принадлежит бактериям — анаэробам и факультативным анаэробам, обладающим мощными протеолитическими ферментами, а также аэробным спороносным бактериям рода Bacillus и неспороносным из рода Pseudomonas. В гниение участвуют и плесневые грибы; роль актиномицетов незначительна. Большинство гнилостных бактерий сапрофиты, некоторые из них способны гидролизовать живую ткань, вызывая заболевания.
Гниение играет важную роль в круговороте веществ в природе: в результате жизнедеятельности и гибели животных и растений в почву и водоёмы попадает много белковых продуктов, которые лишь благодаря деятельности гнилостной микрофлоры не накапливаются, а минерализуются и вновь могут быть использованы растениями. С помощью протеолитических ферментов (протеаз и пептидаз) гнилостные бактерии расщепляют белки на полипептиды и далее на аминокислоты, подвергаемые многими микроорганизмами дезаминированию или декарбоксилированию. В результате дезаминирования выделяется газообразный аммиак, образуются насыщенные и ненасыщенные кислоты жирного и ароматического ряда, кето- и оксикислоты; при декарбоксилировании — амины, многие из которых очень ядовиты. Радикалы аминокислот, появляющиеся в результате дезаминирования и декарбоксилирования, подвергаются дальнейшему распаду. Из триптофана образуются скатол и индол, из серусодержащих аминокислот метионина и цистеина — сероводород; жирные кислоты могут сбраживаться с выделением метана. При гниение без доступа воздуха преобладают восстановительные процессы и накапливаются многие указанные продукты; при свободном доступе воздуха Г. проходит до конца, и весь углерод органических соединений выделяется в виде CO2.
6. Ферментация углеводов как дифференциально-диагностический признак бактерий. Среды Гисса. принципы их конструирования. Оценка результатов роста бактерий на средах Гисса.
Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и — в некоторых случаях — для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред.
Для многих микроорганизмов таксономическим признаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2—6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».
Дата публикования: 2015-02-03; Прочитано: 603 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!