Метод выделения алкалоидов по В.Ф. Крамаренко

Анализируя результаты предшествующих исследований выделения алкалоидов из биологического материала различных ученых, В. Ф. Крама­ренко предложил описанный ниже метод, применяемого на практике химико-токсикологического анализа. 100 г измельченных органов тру­пов вносят в стакан вместимостью 250—500 мл и заливают 0,02 н. раствором серной кислоты с таким расчетом, чтобы твердые частицы биологического материала были покрыты этой жидко­стью. Содержимое стакана перемешивают стеклянной палочкой и с помощью универсального индикатора проверяют рН среды. Если рН среды превышает 2,5, то к смеси биологического мате­риала и подкисленной воды по каплям прибавляют 20 %-й раст­вор серной кислоты до рН-2,5. Содержимое стакана оставляют на 2 ч при периодическом перемешивании, а затем процеживают через марлю. Твердые частицы биологического материала еще дважды настаивают с новыми порциями 0,02 н. раствора серной кислоты, доводя рН до 2,5 и настаивая в течение часа.

Кислые водные вытяжки из биологического материала соеди­няют, переносят в стакан для центрифугирования вместимостью 200 мл и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, а остаток в центрифужном стакане перемешивают стеклянной палочкой и заливают 20—30 мл 0,2 н. раствора серной кислоты. Содержимое центрифужного стакана настаивают в течение 2 ч и центрифугируют. Надосадочную жидкость присоединяют к ранее полученной надосадочной жидкости. Объединенные надосадочные жидкости (центрифугат А) подвергают дальнейшему исследованию.

1. При исследовании загнившегося биологического материала на наличие токсических веществ к центрифугату А прибавляют кристаллический сульфат аммония до насыщения жидкости этим электролитом. Через 1—2 ч образующийся осадок примесей отде­ляют от жидкости центрифугированием. Надосадочную жид­кость сливают с осадка и проверяют степень кислотности этой жидкости. При необходимости жидкость доводят до рН = 2,0...2,5 прибавлением 10%-го раствора серной кислоты. Подкисленную до рН = 2,0...2,5 жидкость дважды взбалтывают с диэтиловым эфиром (по 40 мл). Эфирные вытяжки, содержащие примеси, отделяют от кислой водной фазы и в дальнейшем не исследуют.

Кислую водную фазу подщелачивают 20 % -м раствором гидроксида натрия до рН = 8,5.,.9,0 и 3 раза взбалтывают с хлоро­формом (объем хлороформа, взятый для каждой экстракции, должен быть в три раза меньше объема водной фазы). Хлоро­формные вытяжки соединяют, профильтровывают и на водяной бане отгоняют хлороформ до небольшого объема (10—15 мл). Оставшийся хлороформ выпаривают на воздухе досуха. Сухой остаток растворяют в 10 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. В полученном растворе определяют наличие алкалоидов.

Если раствор сухого остатка в 0,1 н. растворе соляной кисло­ты имеет бурую окраску или содержит окрашенные взвешенные частицы, то его 1—2 раза взбалтывают с равным объемом изо­амилового спирта. Этот спирт, содержащий примеси, отделяют от кислой водной фазы, в которой определяют наличие алкалои­дов и других токсических веществ.

2. При исследовании незагнившего биологического материа­ла осаждение примесей из вытяжек сульфатом аммония не про­изводится. Центрифугат А дважды взбалтывают с диэтиловым эфиром по 30 мл. Эфирные вытяжки отделяют и в дальнейшем не исследуют. Кислую водную фазу подщелачивают 20%-м рас­твором гидроксида натрия до рН = 8,5...9,0 и 3 раза взбалтывают с хлороформом (объем хлороформа для каждой экстракции дол­жен быть в 3 раза меньше, чем объем водной фазы). Хлороформ­ные вытяжки объединяют, и хлороформ отгоняют на водяной бане до небольшого объема (10—15 мл). Оставшийся хлороформ на воздухе выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 10 мл 0.1н. раствора кислоты хлороводородной. В полученном растворе опре­деляют наличие алкалоидов и других токсических веществ.

3. В тех случаях, когда биологический материал подвергают исследованию на наличие ядовитых веществ, экстрагирующихся из кислых водных вытяжек, центрифугат А доводят 20 %-м рас­твором гидроксида натрия до рН = 4...5 и 3 раза взбалтывают с хлороформом. Хлороформные вытяжки объединяют и отгоняют хлороформ, как указано выше. Сухой остаток раство­ряют в 10 мл 0,1н. раствора кислоты хлороводородной. В этом растворе определяют наличие ядовитых веществ, экстрагирующихся из кислой среды.

Таблица7.2

Сравнительная оценка методов изолирования алкалоидов (по данным В.Ф.Крамаренко)

Алкалоид	Процент изолирования по методу
	Стаса-Отто	Васильевой	Крамаренко
Морфии	18-21	21-24	47-51
Кодеин	24-26	ЗЗ^Ю	59-63
Кокаин	17-19	25-32	53-56
Хинин	14-18	23^Н	63-69
Пахикарпин	19-22	54-58	66-70
Стрихнин	22-26	30-34	50-56
Скополамин	11-16	35-39	61-66
Бруцин	29-32	27-33	51-55
Атропин	22-27	31-37	59-64
Время анализа	7-8 дней	4-6ч	4-6ч

Сравнение приведенных методов (см. табл. 4) позволяет провести выбор условий изолирования в зависимости от конкретных условий.

7.2.10. Метод изолирование из биологического материала «лекарственных» ядов нейтральным ацетоном

Метод разработан В. А.Карташовым. В качестве экстрагента им предложен амфифильный растворитель ацетон, который способен смешиваться как с водой, так и с липидами.

Схема метода:

1-й этап. 5 г гомогенизированного биологического материала четырехкратно извлекают аце­тоном последовательно 10,0; 5,0; 5,0 и 5,0 мл с помощью аппарата для встряхивания, каж­дый раз в течение 5 мин. Затем пробы центрифугируют при 2,5 тыс. об./мин в течение 5 мин. Ацетоно-водный экстракт смешивают с 4 г высушенного карбоната калия. Ацетоновый слой отделяют, добавляют 20 мл 0,5 М раствора хлороводородной кислоты и 10 мл н-гексана, встряхивают. Органическую фазу, содержащую гидрофобные примеси, отбрасывают.

2-й этап. Водную фазу экстрагируют эфиром, эфир испаряют и анализируют на вещества кислотного характера. Оставшийся водный раствор подщелачивают 25% раствором аммиака до рН=9-10, добавляют 3 г хлорида натрия (для высаливающего эффекта) и экстрагируют ди­этиловым эфиром. Эфир испаряют и остаток исследуют на вещества основного характера. Оценка метода. Способ позволяет получать достаточно чистые экстракты. В процессе гомогенной экстракции анализируемые вещества практически не теряются. При реэк­стракции потери веществ не превышают 5-6%.

7.2.11. Метод изолирование из биологического материала «лекарственных» ядов

по Степанова-Швайковой

1-й этап. Навеску растительного объекта массой 5 г заливают водой очищенной (1:12), подкисляют щавелевой кислотой до рН=2-2,5 и настаивают 2 ч. Водную вытяжку центри­фугируют в течение 30 мин при 3000 об./мин. Прозрачную жидкость отделяют от осадка.

2-й этап. Центрифугат экстрагируют последовательно хлороформом при рН=2, затем при рН=10 после подщелачивания 25% раствором аммиака.

Каждый хлороформный экстракт исследуются в отдельности на группу «лекарственных» ядов.

7.2.12. Изолирование наркотических и одурманивающих веществ из мочи твердофазной экстракцией

Этот метод является альтернативой жидкостной экстракции. Он основан на сорбции ток­сических веществ на синтетических смолах, модифицированных силикагелях, активи­рованном угле и др. Авторами метода являются Т.И.Бурыкина и Б.Н.Изотов. В качестве сорбента ими предложен полисорб-1 (сополимер стирола и дивинилбензола). Метод раз­работан для выделения, очистки и концентрирования наркотических и одурманивающих веществ из мочи. Ядовитые вещества сорбируются на полисорбе, а затем элюируются соответствующим элюентом.

Схема метода:

Для изолирования веществ кислотного характера мочу (50 мл) подкисляют до рН=2 хло­роводородной кислотой и смесь пропускают через колонку с сорбентом со скоростью 1,5-2 мл/мин. Для изолирования веществ основного характера к 50 мл мочи добавляют раствор аммиака до рН=8-9 и также пропускают через колонку с сорбентом.

Вещества с кислотными и нейтральными свойствами, которые удерживаются гидрофоб­ными группами сорбента, элюируют растворителями средней полярности. Оптимальными элюентами являются этилацетат или смесь ацетона и этилацетата. Вещества основного характера, удерживаемые катионообменными группами сорбента в протонированной форме, элюируются смесью хлороформа и изопропанола (9:1 или 4:1). Органические растворители (элюенты) удаляют при 40°С под током азота. Сухой остаток анализируют. Чувствительность метода находится в пределах 0,06-0,4 мкг вещества в 1 мл мочи.

Оценка метода. Метод сорбции (твердофазной экстракции) позволяет упростить мето­дику подготовки объекта к анализу, обрабатывать до 5 и более проб мочи одновременно, повысить чувствительность обнаружения токсических веществ, получить более чистые извлечения, практически исключить присутствие в элюатах веществ, определяющих за­пах мочи.

В 50 мл мочи методом сорбции можно определить: морфина 20 мкг, кодеина 2-5 мкг, аминазина, дипразина, промедола, пиперазина 4-5 мкг, наркотина 10 мкг, амитриптилина 8-10 мкг, диазепама 5-10 мкг.

Методы выделение барбитуратов из биологического материала

Для выделения барбитуратов из биологического материала долгое время применялись методы, которые были разработаны для выделения алкалоидов. Однако ясно то, что для выделения барбитуратов из объектов биологиче­ского происхождения целесообразно применять специальные методы.