Изолирование алкалоидов подкисленной водой (метод А. А. Васильевой)

Подкисленная вода для изолирования алкалоидов из биологического материала, ввиду доступности, экономичности, безвредности предложенные Усляр и Эрдман в 1861 г нашел широкое применение на практике химико-токсикологического анализа. В качестве подкисляющего агента пред­лагались серная, фосфорная, винная, уксусная и другие кислоты.

Согласно методу А. А. Васильевой, трупный материал измель­чают и заливают водой, подкисленной щавелевой кислотой. Вы­тяжку процеживают через марлю. Процеженную кислую водную вытяжку взбалтывают с хлороформом, который отделяют от вод­ной фазы. После этого кислую водную вытяжку подщелачивают и взбалтывают с хлороформом. В хлороформной вытяжке опре­деляют наличие алкалоидов.

Первые методы изолирования ядовитых веществ из биологи­ческого материала подкисленным этиловым спиртом и подкис­ленной водой, предложенные вначале второй половины XIX ст., применялись только для выделения алкалоидов. Начиная с конца XIX ст. в медицинскую практику все больше начали внедряться синтетические фарма­цевтические препараты, отдельные представители которых в ряде случаев были причиной отравлений. Для выделения этих синте­тических препаратов из биологического материала специальные методы не разрабатывались, а применялись методы, ранее пред­ложенные для исследования алкалоидов.

Все описанные выше методы выделения алкалоидов из био­логического материала имеют ряд недостатков. Согласно этим методам, изолирование алкалоидов и синтетических азотсодер­жащих ядовитых веществ основного характера производилось без учета влияния рН извлекающих жидкостей (подкисленного этилового спирта или подкисленной воды) на степень выделения исследуемых веществ из биологического материала. Не учиты­валось влияние рН среды на экстракцию примесей из алкалоид­ных вытяжек и на экстракцию алкалоидов и их синтетических аналогов из предварительно очищенных вытяжек. Выбор органи­ческих растворителей для экстракции примесей, переходящих из биологического материала в вытяжки, а также для экстракции алкалоидов и других веществ из вытяжек производился эмпи­рически (В.Ф.Крамаренко 1989 г).

7.1.3. Факторы, влияющие на изолирование алкалоидов и других азотистых оснований (синтетические леарственные средства) из биологического материала

При анализе использования предложенных ранее методов выделе­ния алкалоидов из биологического материала установлены влияние различных факторов на степень изолирования токсических веществ.

1. Одним из факторов, влияющие на степень изолирования алкалоидов при вы­делении их из биологического материала является значение рН.

Рядом ученых - А. М. Петрунькина и М. Л. Петрунькин (1928), М. А. Лисицин (1931), X. Ш. Ка­заков (1957) и другими показаны, что связывание алкалоидов с белками в организме происходит в зависимости от рН среды.

Белковые вещества, как производные аминокислот, являются амфотерными соединения­ми. В зависимости от рН среды они могут диссоциировать как кислоты и как основания. Следовательно, в живом организме имеются необхо­димые условия для взаимодействия белковых веществ с алкалои­дами и с другими токсикантами. Установлены, что. при этих значениях рН вещества с основными свойствами связываются с бел­ками при рН, находящемся выше их изоэлектрической точки, а вещества кислотного характера (например: салициловая кислота, препараты барбитуровой кислоты) могут связываться с белками ниже их изоэлектрической точки.

В. Ф. Крамаренко с сотрудниками установили, что соедине­ния белковых веществ с большинством алкалоидов, их синтети­ческих аналогов и других азотистых соединений основного харак­тера разлагаются кислотами при рН=2...3. В связи с этим во всех методах, кото­рые применяются в химико-токсикологическом анализе для изолирования алкалоидов и других азотистых осно­ваний, в настоящее время извлекающие жидкости подкисляют до рН = 2,5...3,0.

2. Следующим фактором влияющий на степень изолирования токсических веществ, природу и количества примесей, переходящих из биологического материала в вытяжки является извлекающая жидкость.

К извлекающим жидкостям, применяемым для изолирования ядовитых веществ из биологического материала, предъявляется ряд требований. Эти жидкости должны хорошо проникать в клет­ки и ткани биологического материала; разрушать связи между ядами и белковыми веществами в тканях; хорошо растворять соли ядовитых веществ, которые образуются в биологическом ма­териале под влиянием кислот, входящих в состав извлекающих жидкостей; растворять как можно меньшие количества примесей, переходящих из биологического материала в вытяжки.

Способность извлекающих жидкостей, применяемых для изо­лирования ядовитых веществ, проникать в ткани трупов, подле­жащих исследованию на наличие ядов, зависит от содержимого клеток и тканей исследуемого биологического материала. Изве­стно, что во внутриклеточной жидкости содержится около 50, а во внеклеточной — около 20 % воды. В мышцах находится 75— 78, а в печени — 70—75 % воды. В связи с наличием большого количества воды в клетках и тканях органов трупов в эти клетки могут проникать вода и смешивающиеся с водой органические растворители. Проникновению в биологический материал орга­нических растворителей, несмешивающихся с водой, препят­ствует вода, находящаяся в клетках и тканях органов трупов. Поэтому органические растворители, несмешивающиеся с водой, не пригодны или малопригодны для изолирования токсических веществ из органов трупов. Они могут применяться для извле­чения физиологически активных веществ из высушенного расти­тельного материала и других объектов, содержащих незначитель­ное количество влаги.

3. На степень изолирования алкалоидов и других азотистых со­единений основного характера из биологического материала оказывает влияние природа кислоты, применяемой для подкисле­ния воды и этилового спирта. В зависимости от природы кис­лоты, содержащейся в извлекающей жидкости, ядовитые веще­ства, находящиеся в биологическом материале, превращаются в нем в соли этой кислоты. Чем лучше растворяются соли ядови­тых веществ в извлекающей жидкости, тем легче изолируются эти яды из биологического материала. Это можно показать на при­мере морфина. Ацетат морфина хорошо растворяется в воде (1: 2,5). Хуже растворяются в воде тартрат (1: 10), затем суль­фат (1: 21) и гидрохлорид (1: 40) морфина. В этиловом спирте лучше растворяется гидрохлорид и ацетат морфина (1: 100), чем сульфат и тартрат (1; 1000) этого алкалоида.

Неодинаковой растворимостью солей морфина в воде и этило­вом спирте объясняется различная степень изолирования этого алкалоида из биологического материала указанными извлекаю­щими жидкостями. При изолировании морфина водой, подкис­ленной серной кислотой, из биологического материала выделя­ются большие количества этого алкалоида, чем при изолировании его этиловым спиртом, подкисленным винной или серной кис­лотой.

В некоторых источниках литературы указывается на непри­годность минеральных кислот для подкисления воды и этилового спирта, применяемых для изолирования алкалоидов из биологи­ческого материала. Это мотивируется тем, что минеральные кис­лоты могут разлагать алкалоиды, являющиеся сложными эфирами, а также подвергать гидролизу белковые вещества, содержащиеся в биологическом материале, загрязняя алкалоидные вытяжки продуктами гидролиза белков (пептидами, аминокислотами и др.).

Известно, что при выделении алкалоидов и других токсиче­ских веществ из биологического материала его настаивают с под­кисленной водой (при рН = 2...3) в течение двух-трех часов. Экс­периментальные данные показывают, что за такое время не про­исходит гидролиз биологического материала и алкалоидов, яв­ляющихся сложными эфирами. Даже для частичного гидролиза белков требуются относительно жесткие условия (более высокая концентрация кислоты и длительное нагревание). Поэтому ра­створы разбавленных минеральных кислот, имеющие рН = 2..,3, как и растворы органических кислот с таким же рН, могут при­меняться для изолирования алкалоидов (в том числе и сложных эфиров) из биологического материала.

Возникают определенные затруднения при выборе извлекаю­щей жидкости для изолирования метаболитов из биологического материала. Большинство ядовитых веществ в организме подвер­гается биотрансформации. В результате этого ядовитые веще­ства, поступившие в организм, частично или полностью превра­щаются в их метаболиты. Поэтому для установления причин отравлений в ряде случаев необходимо производить обнаружение и количественное определение не только ядовитых веществ, но и их метаболитов (кокаин и экгонин, героин и 6- моноацетилморфин и морфин).

Растворимость большинства ядовитых веществ в подкислен­ной воде или в подкисленном этиловом спирте отличается от растворимости их метаболитов в указанных извлекающих жидко­стях. Поэтому иногда трудно подобрать извлекающую жидкость, обеспечивающую совместное изолирование ядовитых веществ и их метаболитов из одной навески биологического материала. В этих случаях ряд авторов рекомендуют производить изолиро­вание ядовитых веществ и их метаболитов из двух навесок био­логического материала. Из одной навески изолируют ядовитое вещество, а из другой — метаболиты.

4. При изолировании ядовитых веществ подкисленной водой или подкисленным этиловым спиртом в вытяжки из биологического материала совместно с ядовитыми веществами переходят при­меси белков, продуктов их гидролиза (пептидов, аминокислот), липидов и ряда других соединений.

Состав и количественное содержание примесей, переходящих в вытяжки, зависят от состава и степени гнилостного разложения биологического материала, от природы извлекающей жидкости, рН среды и от некоторых других факторов.

Известно, что в дистиллированной воде белковые вещества растворяются в незначительных количествах. От при­бавления к воде кислот или оснований растворимость белковых веществ повышается. Таким образом, подкисление воды, приме­няемой для изолирования ядовитых веществ, способствует увели­чению количества белковых веществ в вытяжках из биологиче­ского материала. Гидратация молекул белковых веществ также повышает их растворимость в воде. Гидратированные молекулы белковых веществ легче переходят в водные растворы, чем негидратированные.

В подкисленную воду переходят и отдельные аминокислоты, являющиеся продуктами гидролиза белковых веществ, в трупном материале. С увеличением длины углеродной цепи в молекулах амино­кислот растворимость их в воде понижается, а растворимость в этиловом спирте повышается. Поэтому в кислые водные вытяж­ки из биологического материала в основном переходят амино­кислоты, имеющие относительно короткую цепь углеродных атомов, а в кислые спиртовые вытяжки наоборот.

Липиды, в виду их нерастворимости в воде, практически не переходят в кислые водные вытяжки из биологического мате­риала. Однако в подкисленный этиловый спирт из биологического мате­риала в основном переходят липиды, часть белковых веществ, некоторые аминокислоты и другие примеси.

К числу липидов относятся: жиры, жирные кислоты, воски, алифатические спирты, фосфоглицериды, липопротеиды, холестерин и ряд других веществ.

За небольшим исключением белковые вещества не растворя­ются в этиловом спирте. Под влиянием этилового спирта и других органических растворителей, смешивающихся с водой (метило­вый спирт, ацетон и др.), происходит денатурация белков. От прибавления этилового спирта к биологическому материалу по­нижается степень гидратации белковых веществ, уменьшается их растворимость.

Растворимость белковых веществ и их осаждение в значитель­ной степени зависят от диэлектрической проницаемости раство­рителей. Диэлектрическая проницаемость этилового спирта (D = 24) ниже, чем у воды (D = 80). При понижении диэлектриче­ской проницаемости растворителей силы притяжения между мо­лекулами растворенных веществ возрастают. В результате этого под влиянием этилового спирта происходит агрегация молекул белковых веществ, понижается их растворимость и происходит выпадение в осадок (см. методы Стаса-Отто и Е.М. Саломатина).

Кроме природы растворителей, их диэлектрической проницае­мости и рН среды на растворимость белковых веществ, влияет ионная сила растворов, зависящая от всаливающей и высаливающей концентрации электролитов в этих растворах.

При изолировании ядовитых веществ подкисленным спиртом может происходить денатурация белковых веществ на поверх­ности кусочков биологического материала. В результате этого создаются затруднения для проникновения этилового спирта в биологический материал и для практически полного извлечения из него исследуемых веществ этим спиртом.

Кроме всего, эффективность перехода токсического вещества из тканей биологического материала в извлекающую жидкость регулируется законами диффузионного процесса. К ним относятся: площадь поверхности контакта извлекающей жидкости с биологическим материалом (достигается измельчением тканей до оптимальных размеров); температура, перемешивание, кратность извлечений и его продолжительность и др.

До настоящего времени остается не изученным вопрос о за­грязнении вытяжек, полученных при настаивании гнилостного биологического материала с подкисленной водой и подкисленным этиловым спиртом. Это объясняется тем, что в гнилостном био­логическом материале содержится значительное число продуктов гниения, принадлежащих к различным классам химических со­единений (см. гл. гниение). Число и состав этих соединений зави­сят от сроков и условий гниения биологического материала. При изолировании токсических веществ из гнилостного биологиче­ского материала продукты гниения в зависимости от их раство­римости могут переходить как в подкисленную воду, так и в под­кисленный этиловый спирт.

Многие продукты гнилостного разложения биологического материала дают такие же реакции, как и некоторые ядовитые вещества. Поэтому при исследовании гнилостного биологического материала на наличие ядовитых веществ, требуется тщательная очистка водных и спиртовых вытяжек от примесей, являющихся продуктами гниения объектов биологического происхождения.

7.1.4. Очистка вытяжек из биологического материала от примесей

Вытяжки, полученные настаиванием биологического материа­ла с подкисленной водой или с подкисленным этиловым спиртом, всегда содержат определенное количество примесей белковых веществ, аминокислот, липидов и других соединений, мешающих обнаружению и количественному определению ядовитых веществ, находящихся в этих вытяжках. В связи с этим вытяжки из био­логического материала подвергают очистке от примесей.

Известно несколько способов очистки вытяжек. Для этой цели применяется фильтрование, центрифугирование, осаждение, экс­тракция и ряд физико-химических методов (см.гл.5, 5.7.).

Необходимо отметить, что методы очистки вытяжек, основан­ные на осаждении примесей, имеют и некоторые недостатки. Осадки примесей могут адсорбировать на своей поверхности от­дельные, подлежащие исследованию, токсические вещества. Ад­сорбция токсических веществ осадками примесей может быть одной из причин потерь исследуемых веществ в ходе химико-ток­сикологического анализа.

Экстракция примесей из вытяжек. В химико-токсикологиче­ском анализе для очистки вытяжек из биологического материала метод экстракции применяется более часто, чем другие методы. При помощи метода экстракции можно очистить вытяжки от липидов, аминокислот, продуктов их декарбоксилирования и дезаминирования, а также от ряда других примесей. Экстракция примесей из вытяжек успешно проходит только тогда, когда пра­вильно выбран несмешивающийся с водой органический раство­ритель и установлено соответствующее значение рН среды, из которой извлекают примеси. При неправильно выбранном рН среды совместно с примесями может экстрагироваться и опреде­ленное количество исследуемого вещества. Экстракция примесей должна производиться при таком значении рН среды, при кото­ром не экстрагируются исследуемые вещества, находящиеся в вытяжках.

7.1.5. Экстракция алкалоидов и других токсических веществ из вытяжек

В современном химико-токсикологическом анализе экстрак­ция является одним из основных методов выделения алкалоидов и других токсических веществ из вытяжек, биологических жид­костей (мочи, крови), промывных вод желудка и ряда других объектов. Теоретические основы методов экстракции описаны выше (см. гл. 5).

Алкалоиды и другие токсические вещества, изолированные из биологического материала, долгое время подразделяли на две группы: вещества, экстрагирующиеся органическими раствори­телями, несмешивающимися с водой, из кислых вытяжек, и ве­щества, экстрагирующиеся теми же растворителями из подщело­ченных вытяжек. Однако такое подразделение ядовитых веществ на две группы является условным. Большинство ядовитых веществ, изолируемых из биологического материала подкисленной водой или подкисленным этиловым спиртом, в определенной степени экстрагируется несмешивающимися с водой органическими растворителями как из кислой, так и из щелочной среды.

Впервые на кафедре токсикологической и аналитической хи­мии Львовского медицинского института, а затем и на ряде кафедр других институтов изучена зависимость степени экстрак­ции свыше пятидесяти алкалоидов, их синтетических аналогов и других ядовитых веществ от рН среды и природы органических растворителей.

Влияние рН среды и природы органических растворителей на экстракцию некоторых алкалоидов приведено в табл. 7.1

Данные, приведенные в табл. 7.1 подтверждают известное пра­вило, согласно которому большинство алкалоидов экстрагируется органическими растворителями из щелочной среды. Однако почти все алкалоиды в определенной степени экстрагируются и из кис­лых растворов.

Для каждого алкалоида имеется область значений рН, при которой он экстрагируется несмешивающимися с водой органи­ческими растворителями в максимальных количествах. В даль­нейшем этот интервал значений рН будем называть областью максимума экстракции. Известны алкалоиды (колхицин, кофеин, наркотин, теобромин и др.), область максимума экстракции ко­торых находится в кислой среде или на границе кислой и щелоч­ной сред. Однако в определенных количествах эти алкалоиды экстрагируются и из щелочной среды. Алкалоиды, область мак­симума экстракции которых находится в щелочной среде, частич­но экстрагируются и из кислой среды. Область максимума экстракции некоторых алкалоидов и других ядовитых веществ зависит от природы органи­ческих растворителей, применяемых для извлечения этих веществ из водных растворов и от характера вытяжек из биологического материала.

Таблица 7.1

Зависимость степени экстракции некоторых алкалоидов от рН среды и природы органических растворителей

Алкалоид	Органический растворитель	рН начала, экст­рак­ции	Интервал рН соответству­ющий мак­симуму экст ракцнн	Макси­мальное количест­во экстра гируемоп алкалоид,: %	Автор
Анабазин	Хлороформ Дихлорэтан Диэтиловый эфир Бензол	1,9 1,9 2,4   3,5	9,7—11,7 9,7—11,7 9,2—11,7   9,7—11,7	94—95 61—71 21—23   60—70	Баик С. И.
Галантамин	Хлороформ Дихлорэтан Диэтиловый эфир Бензол	3,0 4,0 5,0   5,0	8,0—10,0 9,0—10,0 10,0-11,0   9,0—10,0	97—99 91-94 37—38   84—88	Михно В. В.
Кокаин	Хлороформ Диэтиловый эфир Бензол	3,0 4,0   4,0	7,0—8,5 8,0—8,5   7,0—8,5	80—83 57-62   68—70	Крамаренко В. Ф.
Колхицин	Хлороформ Дихлорэтан Бензол	1,5 1.5 1.5	4,0—8,0 4,0—7,0 4,0—8,0	90— 96 91— 93 20—25	Светлич­ная В. И.
Кофеин	Хлороформ Дихлорэтан Диэтиловый эфир	1.8 1,8 1.8	4,0—5,5 4,0—5,5 4,0—5,5	96—98 82—86 3 —4	Шкадова А. И.
Наркотин	Хлороформ Дихлорэтан Диэтиловый эфир	1.0 1,0 2,4	4,0—7,0 5,0—7,0 5,0—7,0	91—93 76—78 83-85	Рокач 3. С.
Платифиллин	Xлороформ Дихлорэтан Диэтиловый эфир	4,0 5,0 6,0	9,0—12,0 9,0—12,0 9,0—12,0	91—94 90—93 66—70	Егорова Э. И.
Секуренин	Хлороформ Дихлорэтан Диэтиловый эфир	3,0 3,0 4,0	7,0—9,0 7,0—9,0 9,0—10,0	43—47 48—50 45—46	Михно В. В.
Скополамин	Хлороформ Диэтиловый эфир Бензол	5,0 6,7   4,9	8,8—10,5 9,8—10,5   9,0—10,0	88—90 40—43   76—78	Акопян О. А.
Теобромин	Хлороформ Дихлорэтан Диэтиловый эфир	2,1 2,1 2, 1	4.0- 7,0 6.1— 8,0 4,0-7,0	32—37 12—22 4-6	Шкадова А. И.

Исследователями установлено, что указанные выше законо­мерности экстракции касаются не только алкалоидов, но и их синтетических аналогов, являющихся азотсодержащими органи­ческими веществами основного характера.

Для обеспечения полноты извлечения «лекарственных» ядов кислого, нейтрального и основного характеров из растворов необходимо экстрагировать их при рН, находя­щемся в области максимума экстракции, пользуясь органически­ми растворителями, обеспечивающими извлечение максимальных количеств этих веществ.

Степень экстракции токсических веществ, не обладающих основными или кислотными свойствами, в основном зависит от природы органических растворителей и не зависит (или мало зависит) от рН среды.

Расчет степени экстракции, константы распределения и числа повторных экстракций, необходимых для практически полного извлечения исследуемых веществ из растворов, следует произво­дить при помощи формул, приведенных выше (см. гл. 5).

7.2. Обнаружение ядовитых веществ, изолируемых подкисленной водой или подкисленным этиловым

К числу ядовитых веществ, которые изолируются из биологи­ческого материала подкисленной водой или подкисленным этило­вым спиртом, в основном относятся алкалоиды, их синтетические аналоги, барбитураты и некоторые другие вещества, обладающие кислотными свойствами. Для обнаружения их применяют реакции осаждения, цветные реакции, физи­ческие, физико-химические методы анализа, а в ряде случаев проводят фармакологические пробы и фармакогностический анализ..