Практическая работа ПЗ № 14

«Определение количества форменных элементов, гемоглобина и группы крови у человека»

Количество форменных элементов принято выражать числом их в 1 мм³ или в 1 литре крови. Подсчет их производится при помощи счетных камер. Для удобства подсчета кровь предварительно разбавляется в 100 или 200 раз при подсчете эритроцитов и в 10 или 20 раз при подсчете лейкоцитов.

Прибор для счета форменных элементов состоит из смесителя и счетной камеры Горяева.

Смеситель состоит из градуированной стеклянной трубочки (4) с яйцевидным расширением - ампулой. В ампулу помещен стеклянный шарик для лучшего размешивания кровяной смеси. Имеются смесители для подсчета красных и смесители для подсчета белых кровяных телец. При помощи смесителя кровь разбавляется в строго определенных пропорциях. На капилляре имеются метки: 0,5 и 1,0. Около верхнего суже­ния ампулы в смесителях для эритроцитов поставлена цифра 101.

Емкость ампулы в 100 раз больше емкости капилляра. Поэтому, наполняя капил­лярную часть трубки кровью до метки 1 и вслед затем, набирая разбавляю­щую жидкость до метки 101, мы разводим кровь в 100 раз. При взятии крови до метки 0,5 и добавлении раствора до метки 101 кровь разбавится в 200 раз. В смесителях для лейкоцитов имеется метка 11 вместо 101. Емкость ампулы здесь в 10 раз больше емкости капилляра и, следовательно, кровь разбавится в 10 или 20 раз.

Счетная камера Горяева (1, 2). В этой ка­мере имеются 2 сетки, нанесенные на поверхность узкой стеклянной пластинки, разделенной посередине на две части желобком, вытравленным в стекле пластинки. Сетки расположены по обе стороны желобка. По обеим сторонам этой пластинки имеются узкие стеклянные полоски, отделенные от счетных поверхностей желобками. Толщина боковых пластинок больше толщины сред­ней полоски на 0,1 мм, и при наложении на них покровного стекла над счетной поверхностью образуется пространство в 0,1 мм высотой.

Сетка Горяева состоит из 225 квадратов, расположенных в 15 рядах по 15 клеток в каждом ряду. Квадраты образованы пересечением 16 продольных и 16 поперечных штриховых линий. Добавочными поперечны­ми и продольными штриховыми линиями каждый третий квадрат сетки разделен на 16 маленьких квадратиков. Всего на сетке имеется 25 таких квадратов по 16 квадратиков в каждом. Сторона маленького квадратика равняется 1/20 мм - площадь квадратика равняется 1/20 * 1/20 = 1/400 мм². При накладывании покровного стекла на счётную камеру промежуток над квадратами равен 1/10 мм, тогда объем малого квадрата равен 1/400 мм² * 1/10 мм = 1/4000 мм³.

Исследование № 1. Подсчёт количества эритроцитов

Цель работы: ознакомится с методикой подсчёта эритроцитов у человека и с оценкой полученных данных.

Оборудование: микроскоп с объективами малого и большого увеличения; счётная камера Горяева; смеситель для эритроцитов; скарификатор; покровные стёкла; 3% раствор хлористого натрия; спирт; эфир; вата; йод; дистиллированная вода.

Ход исследования. Рассматривают сетку счетной камеры под микроскопом при малом и большом увеличении. Камеру покрывают покровным стеклом и притирают покровное стекло так, чтобы между ним и боковы­ми пластинками камеры появились цветные кольца. Приготовляют растворы для разбавления крови: 2—3-процентный раствор NaCl или консервирующую жидкость. Тщательно протирают место укола спиртом. Кожа должна быть суха, иначе капля крови растечется, вместо того, чтобы принять удобную для насасывания шарообразную форму. Делают укол скарификатором такой глубины, чтобы капля крови выступала свободно без выдавливания. Когда появится капля достаточной величины (первую каплю снять сухой марлей), опускают кончик смесителя в глубину капли (не надавливая) и насасывают кровь до метки 0,5, следя за тем, чтобы в капилляр не попало пузырьков воздуха. Затем кончик смесителя обтирают ваткой, опускают его в стаканчик с разбавляющей жидкостью и насасывают ее до метки 101. Насасывание крови и раствора следует производить, возможно, быстрее, чтобы кровь не свернулась в капилляре. Тщательно перемешать кровь с раствором, закрыв большим и средним пальцами смеситель с обоих концов и поворачивая и встряхивая его в разных направлениях в течение 2—5 мин.

Слегка надавливая на резиновую трубку, удаляют жидкость из капил­лярной части смесителя, и кончик его обтирают марлей. Затем каплю жидкости наносят на поверхность счетной камеры, на конец средней пластинки. В силу капиллярности капля тотчас же всасывается в счетную камеру. Камеру помещают под микроскоп, и устанавливают сетку в поле зрения сначала под малым, затем под большим увеличением. Выждав 2 мин, чтобы эритроциты осели на дно, производят подсчет их в 80 маленьких квадра­тиках сетки (5 больших квадратов по 16 маленьких).

Для этого находят в поле зрения левый верхний квадрат, разделенный на малые квадратики, и подсчитывают число эритроцитов в каждом из 16 входящих в него маленьких квадратиков, передвигая сетку сначала слева направо, пока не будут просчитаны эритроциты 4 верхних квадратиков. Передвигая сетку справа налево, переходят к счету телец в 4 квадратиках следующего ряда, затем подсчитывают в четырех квадратиках третьего и, наконец, четвертого ряда. Чтобы избежать повторного подсчета одних и тех же кровяных телец, в каждом квадратике подсчитывают все эритроциты, лежащие внутри квадратика и расположенные на верхней и левой его границе, и не считают те, которые расположены на правой и нижней погра­ничных линиях. Сосчитав число эритроцитов в левом верхнем квадрате (16 маленьких квадратиков), передвигают сетку по диагонали и сосчитывают следующий квадрат, состоящий из 16 квадратиков, затем, передвигая сетку дальше по диагонали, подсчитывают число эритроцитов в следующих квад­ратах, пока не сосчитают во всех 5 квадратах, лежащих по диагонали.

Вычисляют общее количество эритроцитов в 1 мм³ крови. Для этого общее количество телец, сосчитанных в 5 больших квадратах (80 маленьких квадратиках), умножают на 10 000, исходя из следующих соображений. Допустим, что общее число эритроцитов в 80 квадратиках равно А. Тогда в среднем на каждый маленький квадратик приходится А/80 телец. Объем жидкости над каждым квадратиком равен 1/400 * 1/10 = 1/4000 мм ³. Следова­тельно, число эритроцитов в 1 мм³ жидкости равно А/80 * 4000. Кровь разбавлена в смесителе в 200 раз.

В 1 мм³ крови число эритроцитов (Х) равно:

Х = А * 4000 * 200 / 80 = А * 10000.

В норме у человека содержится в 1 мм³ крови около 5 млн. эритроцитов у мужчин и около 4,5 млн. — у женщин.

Исследование № 2. Подсчёт количества лейкоцитов

а) Определение количества лейкоцитов в крови человека в покое.

Цель работы: ознакомится с методикой подсчёта лейкоцитов у человека и найти различия числа лейкоцитов до и после мышечной работы.

Оборудование: камера Горяева; смеситель для лейкоцитов; раствор уксусной кислоты 1-3% подкрашенной в голубой цвет метиленовой синью; скарификатор; покровные стёкла; спирт; эфир; вата; йод; дистиллированная вода.

Ход исследования. Для определения числа лейкоцитов кровь разбавляет­ся в 10 или 20 раз. Для этого применяют специальный смеситель (смеситель для белой крови). Для разведения крови служит 1—3-процентный раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовой синью. Уксусная кислота разрушает эритроциты, а метиленовая синь окрашивает ядра лейкоцитов. При подсчете лейкоцитов применяют те же приемы, что и при определе­нии числа эритроцитов, но подсчет нужно производить в 25 больших квадратах или 400 маленьких квадратиков камеры Горяева, последовательно передвигая камеру при помощи крестообразного столика. Полученное число умножают на 100 при разведе­нии крови в 10 раз и на 200 при разведении в 20 раз, исходя из следующего. Допустим В — число лейкоцитов в 400 маленьких квадратиках камеры, следовательно, на 1 квадратик приходится в среднем В / 400 телец; объем 1 квадратика = 1 / 4000 мм³. В 1 мм³ жидкости будет содержаться: В * 4000 / 400 лейкоцитов. Кровь была разведена в 10 раз. Следовательно, в 1 мм³ крови число лейкоцитов (Х) будет:

Х = В * 4000 * 10 / 400 = В * 100 лейкоцитов.

В норме у человека в 1 мм³ крови содержится 6—8 тыс. лейкоцитов.

б) Определение количества лейкоцитов при мышечной работе.

Ход исследования. Испытуемый производит бег на месте в течение 3-х минут (частота шагов 180 в минуту). После этого быстро делаем забор крови из пальца аналогично исследованию № 1 и определяем количество лейкоцитов выше указанным методом.