Свойства генетического кода 4 страница

Сейчас у сельскохозяйственных животных изучено более 150 полиморфных локусов белков крови, молока, тканей, расположенных в аутосомах. В связи с кодоминантным наследованием большинства биохимических систем фенотип животного соответствует его генотипу, поэтому фенотип можно записать HbAA или HbA, HbBB или HbB.

Замещение аминокислот в белке может вызвать функциональные различия полиморфных форм. Например, у человека, кроме нормального гемоглобина HbA, известно более 50 патологических форм S,C,G, которые вызывают различные гемоглобинопатии (серповидно-клеточная анемия S, талассемия C). Одним из первых был открыт гемоглобин серповидных эритроцитов, который от нормального отличается заменой в шестом положении глутаминовой аминокислоты на валин. В районах распространения тропической малярии лица, гомозиготные по HbsHbs, погибают в раннем возрасте от серповидно-клеточной анемии. Гетерозиготы HbAHbs устойчивы к малярии, а люди с нормальным генотипом HbAHbA предрасположены к заболеванию. Это неоспоримый пример сбалансированного полиморфизма, когда приспособленность гетерозигот выше, чем гомозигот, а оба аллеля сохраняются в популяции с промежуточной частотой. Это доказывает существование однолокусного гетерозиса по устойчивости к болезни.

Гемоглобин выполняет важную для организма функцию переноса кислорода из органов дыхания к тканям и переноса углекислого газа от тканей в органы дыхания. У крупного рогатого скота открыто 10 типов гемоглобина, но у скота швицкой, костромской, джерсейской пород встречаются аллели HbВ. У животных черно-пестрой, айрширской, герефордской – один тип А. В Австралии, а потом в Кении у породы овец ромни-марш с типом гемоглобина HbА найдена более высокая резистентность к гемонхозу (нематоды, паразитирующие в сычуге), чем у животных с HbВ и HbАВ. Устойчивость овец к лептоспирозу связана с гетерозиготностью по гемоглобиновому локусу (HbАВ), тогда как особи с типом А и В были более восприимчивыми. У свиней найдена ассоциация лептоспироза с аллелем белка амилазы AmA.

Хорошо изучен полиморфизм трансферрина (Tf), который переводит железо плазмы в диионизированную форму и переносит его в костный мозг, где оно используется вновь для кроветворения. Трансферрин подавляет размножение вирусов в организме. Количество этого белка снижается при циррозе печени, инфекциях. Известно 12 типов трансферрина, но среди европейских пород наиболее часто встречаются аллели A, D1, D2 и E. Схема расшифровки электрофореграмм представлена на рисунке. Многие европейские породы скота имеют очень низкую частоту типов трансферрина Tf A и TfF. У коров бурой латвийской и костромской пород с TfDD удой был выше на 256-270 кг, чем у животных с другими генотипами.

Белок церулоплазмин (Cp) играет центральную роль в обмене меди в организме, являясь основным переносчиком ее в ткани. Нарушение функции церулоплазмина или снижение его содержания в плазме крови ведет, например, у человека к возникновению генетического заболевания нервной системы с некротическими изменениями в печени.

Иммуногенетический анализ белковых систем исследовал Баранов О.К., 1981 г. Аллоантигены сывороточных белков называют аллотипами. У американской норки выявлено 8 аллотипов липопротеина (Lpm). Липопротеины транспортируют липиды. Аллотипы наследуются аллогруппами. Совокупность сцепленных генов одной хромосомы, контролирующих аллогруппу, называют гаплотипом. У свиней идентифицированные аллотипы липопротеина детерминируются генами пяти локусов p, r, s, t, u. Имеются данные о связи некоторых типов Lpp с атеросклерозом у свиней.

Изучение девяти полиморфных систем белков у 10 главных групп скота позволило подтвердить вывод о том, что зебувидный скот Индии значительно отличается от европейских пород и принадлежит другому виду (Bos indicus).

Белок лактоглобулин в связи с аллелем (бетта-LgA) свидетельствует о снижении жира в молоке коров черно-пестрой породы.

Тем самым биохимические маркеры делаются важными элементами современной биотехнологии, как для суждения о генетических процессах, так и для диагностики оценки сбалансированности обмена веществ у отдельных животных. Новым направлением в использовании биохимических маркеров в животноводстве является так называемое геноэкологическое направление.

Первичные (врожденные) дефекты иммунной системы

Первичные иммунодефициты – это генетически обусловленная неспособность организма реализовывать то или иное звено иммунного ответа (Р.В.Петров, 1983). Вторичные иммунодефициты являются приобретенными в течение индивидуального развития на фоне лейкоза, ионизирующего излучения, недостаточного кормления.

У сельскохозяйственных животных изучены следующие иммунодефициты.

Комбинированный иммунодефицит (CID). Известен у человека, жеребят арабской породы и таксы. У новорожденных жеребят очень мало или нет циркулирующих лимфоцитов, а в сыворотке крови почти отсутствуют иммуноглобулины. Животные не способны отвечать на иммунизацию. Наблюдается гипоплазия (недоразвитие) тимуса. Жеребята остаются здоровыми до 2-месячного возраста, а после уменьшения материнских иммуноглобулинов погибают к 5 месяцам от инфекций. Эта болезнь наследуется как аутосомно-рецессивный признак. Болезнь встречается у самок и самцов.

Летальный признак А-46 у скота черно-пестрой датской и фризской пород является аутосомно-рецессивным. Телята рождаются нормальными, но к 4-8 неделе у них отмечается поражение кожи, сыпи, алопеция (выпадение волос), паракератоз (аномальное ороговение) вокруг рта, глаз, нижней челюсти. У них снижен клеточный иммунитет и без лечения погибают в 4-месячном возрасте. Выражена потребность в цинке.

Агаммаглобулинемия представляет дефект гуморальной системы (В-лимфоцитов). Встречается у человека и лошадей. Признак сцеплен с полом (Х –хромосомой). Животные неспособны синтезировать иммуноглобулины всех классов, но функция Т-лимфоцитов нормальная. Восприимчивы к бактериальным инфекциям. Жеребята доживают до 17-18 мес, тогда как с комбинированным иммунодефицитом – до 5 мес. Это указывает на важную роль Т-лимфоцитов в резистентности жтвотных.

Селективный дефицит IgM встречается у лошадей и характеризуется частичным или полным отсутствием IgM в сыворотке крови. Жеребята погибают в 4-8 мес возрасте от респираторных инфекций. А если доживают до 2 лет, то плохо растут.

Интересным и важным для практики является дальнейшее изучение первичных дефектов всех звеньев иммунологической системы.

Лекция 12. Генетическая инженерия и биотехнология

Генетическая инженерия – это область молекулярной генетики, разрабатывающая методы конструирования новых функционально активных генетических программ. В 1972 г. П.Берг в США создал первую рекомбинантную молекулу ДНК. Важную роль в генетической инженерии играют ферменты, с помощью которых можно получать определенные фрагменты ДНК и сшивать их, например рестриктазы (рестригирующие эндонуклеазы) и лигазы, которые лишены видовой специфичности, поэтому можно получать фрагменты ДНК и сшивать их независимо от того, из одного или разных организмов они выделены. В 1977 г. Сенжером Ф. И Гильбертом У. был разработан метод секвенирования (расшифровки) первичной структуры ДНК, который позволяет определить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК с предельным разрешением в один нуклеотид.

Генная инженерия решает следующие задачи:

· Синтез или выделение соответствующего гена;

· Включение данного гена в вектор, обеспечивающий его размножение (клонирование);

· Осуществление переноса гена с помощью вектора в клетку-реципиент и включение в ее геном (трансгенез);

· Функционирование гена в клетке-реципиенте (адаптация гена).

Биотехнология – это наука использования живых организмов и биологических процессов в производстве. Современная биотехнология представляет собой новую форму промышленной технологии, основу которой составляют биологические объекты – животные, растения, ткани различных органов, соматические клетки, размножаемые вне организма, микроорганизмы – бактерии, грибы.

Получение генов

Известны два способа искусственного синтеза генов вне организма – химический и ферментативный. В 1969 г. американский ученый Корана синтезировал ген аланиновой тРНК дрожжей химическим путем. Этот ген включал 77 пар нуклеотидов, последовательность которых была уже расшифрована. Сначала синтезировали фрагменты ДНК длиной от 5 до 12 нуклеотидов, затем соединили их в определенном порядке при помощи открытого к тому времени фермента лигазы. Ген не функционировал, так как не имел регуляторных элементов – промотора, где локализована точка инициации синтеза, и терминальных кодонов, которые дают сигнал о завершении синтеза иРНК.

В 1976 г.Корана с сотрудниками по той же методике завершили работу по химическому синтезу отрезка ДНК кишечной палочки, включающего ген супрессорной тирозиновой тРНК протяженностью 126 пар нуклеотидов и примыкающие к нему два регуляторных участка: промотор, содержащий 52 пары нуклеотидов, и терминатор – 21 пару, и прикрепленные к концам отрезка тетрануклеотиды (липкие концы) ААТТ и ТТАА. В этом случае искусственно синтезированный ген при введении в живую кишечную палочку оказался работоспособным.

В 1970 г. Темин, Мизутани и Балтимор обнаружили фермент обратную транскриптазу (ревертазу). В 1972 г. было открыто, что некоторые онкогенные вирусы при помощи фермента обратной транскриптазы могут синтезировать ДНК, используя в качестве матрицы РНК (и даже синтетические полирибонуклеотиды).

Под ферментативным синтезом гена имеют в виду транскрибирование комплементарной нити ДНК (гена) на молекулах РНК в пробирке. В пробирку, содержащую физиологическую бесклеточную среду, вносят дезоксинуклеотидтрифосфаты всех четырех типов (А, Г, Т, Ц), фермент ревертазу, мРНК, кодированную природным геном, копию которого планируется получить. В качестве «затравки», ускоряющей реакцию, вносят небольшие участки молекулы ДНК, содержащие 8-10 повторов тимина. На мРНК обратная транскриптаза синтезирует комплементарную ей нить ДНК. Затем на синтезированной нити ДНК строится вторая комплементарная ей нить ДНК. В результате получают фрагмент двойной спирали ДНК – точную копию того гена, с которого была транскрибирована мРНК.

Выделение генов

Впервые выделить ген методом трансдукции удалось Дж. Бексвиту с сотрудниками. Они показали, что бактериофаг Y при размножении в клетке E.coli может захватить и встроить в свой геном полный лактозный оперон бактерии вместе с примыкающим к нему геном-регулятором. Фрагмент ДНК E.coli встраивается в геном фага Y встрогом порядке: структурные гены z, a, y, оператор - o, промотор p и регулятор i. Применением денатурации и центрифугирования из ДНК-фага был выделен лактозный оперон и ген-регулятор E.coli. Этот метод выявился специфичным и не пригодным для широкого использования. В настоящее время генетическая инженерия использует методы, позволяющие одновременно выделить из молекулы ДНК фрагмент соответствующего гена и встроить его в вектор, посредством которого он может быть размножен и включен в геном клетки-реципиента.

Фрагменты ДНК содержащие ген, чаще всего получают с помощью ферментов – рестриктаз. Эти ферменты разрезают молекулу ДНК в строго определенном месте, где находятся нуклеотиды, распознаваемые данной рестриктазой. Векторами могут быть плазмиды, бактериофаги (см. раздел биохимическая генетика), вирусы, космиды. Векторы включают фрагменты ДНК, соответствующие определенному гену, и переносят их в клетку-реципиент (рис.1, 2).

Плазмиды – мелкие кольцевые молекулы ДНК, присутствующие в клетках бактерий. Они содержат дополнительную генетическую информацию, способны автономно, независимо от ДНК хромосом, реплицироваться; некоторые плазмиды обладают способностью встраиваться в хромосому бактерии и выходить из нее; некоторые могут переходить из одной клетки в другую. В генетической инженерии наиболее широко используется три типа плазмид F, P и Col. Метод создания рекомбинантных плазмид был разработан П.Бергом в 1972г. Ими была создана рекомбинантная плазмида, содержащая галактозный оперон E.coli. В плазмиду могут быть включены природные или синтезированные гены. После проникновения в клетку бактерии рекомбинантная плазмида может функционировать и размножаться автономно, либо включаться в ДНК хромосомы бактерии. Таким методом в клетки бактерии были введены гены человека и созданы штаммы бактерий-суперпродуценто соматостатина, интерферона, инсулина, гормоны роста человека, быка, глобин животных и человека.

Рис. 1. Ферментативный синтез гена и встраивание его в векторную плазмиду (по С. М. Гершензону)

Рис. 2. Типичный опыт генетической инженерии (по Beckingeham-Smith, 1975)

Вирусы – используют в качестве векторов, проникающих в животные клетки. Наиболее широко в генетической инженерии используют обезьяний онкогенный вирус ОВ40. Геном этого вируса обладает способностью встраиваться в хромосомы клеток млекопитающих. Таким образом цепи гемоглобина мыши и кролика были перенесены в клетки обезьян, где они активно функционировали.

Космиды – векторы, полученные путем объединения небольших фрагментов ДНК бактериофага Y и плазмид. Космиды содержат гены, обеспечивающие их размножение в бактерии (например, ген устойчивости к антибиотику тетрациклину). С помощью этих векторов гены могут быть перенесены в бактериальные, растительные и животные клетки, культивируемые iv vitro.

Производство инсулина

В 1980 г. с помощью плазмиды в клетки T.coli был введен ген, контролирующий синтез инсулина человека. Для этого из клеток человека была выделена зрелая мРНК, кодирующая синтез инсулина. С помощью обратной транскриптазы с этой м-РНК была получена комплементарная копия – кДНК. Цепочка мРНК была разрушена и с помощью фермента ДНК-полимеразы синтезировали вторую комплементарную нить ДНК. Чтобы синтезированный ген можно было встроить в вектор, к его концу с помощью фермента лигазы были «пришиты» короткие нуклеотидные последовательности – линкеры, которые узнаются рестриктазой Бам 1. Плазмиду и кДНК обрабатывают рестриктазой Бам 1, затем ферментом лигазой и получают рекомбинантную плазмиду, которую вводят в клетку бактерии, приобретающей способность синтезировать про-инсулин.

Биотехнология соматотропина

В 1977 г. Г.Бойер с сотрудниками химическим путем синтезировал ген соматостатина – гормона роста человека. Ранее было определено, что соматостатин включает 14 аминокислот. Была известна и последовательность расположения аминокислот в этом пептиде. На основании этих данных авторы определили последовательность нуклеотидов и синтезировали участок ДНК, соответствовавший гену соматостатина. С целью защиты полученного гена от разрушения ферментами было решено соединить его с геном белка, вырабатываемого клеткой-хозяина. Ген соматостатина присоединили к отрезку галактозного оперона – гену галактозидазы кишечной палочки, который содержал и промотор для считывания этого гена. Как и предполагали ученые, наследственная информация считывалась с гена соматостатина сразу же вслед за геном галактозидазы. Для остановки считывания в коней гена соматостатина был включен кодон, не несущий информации. Для того, чтобы выделить соматостатин из полученного сложного белка, к началу его гена был включен кодон метионина. В качестве вектора использовали рекомбинантную молекулу, которая состояла из небольшой плазмиды, сконструированной заранее с введенным в нее геном pBR322-галактозидазы. После введения рекомбинантной молекулы в кишечную палочку в общем белке клетки, как и ожидалось, обнаружился соматостатин.

Биотехнология производства интерферона (IFN).

Интерфероны используются в ветеринарной практике для профилактики и лечения вирусных заболеваний, как противоопухолевое средство для лечения раковых заболеваний; являются иммуномодуляторами, выступая при этом в качестве регуляторов иммунных реакций; проявляют антимикробную активность и радиозащитное действие.

Разработка биотехнологии производства интерферона – сложный процесс, требующий строгой регламентации действий на многочисленных этапах. Рассмотрим получение интерферона с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Рекомбинантную молекулу ДНК получают встраиванием определенных генов в ДНК. С помощью ферменто-рестриктаз «разрезают» участки исходной ДНК и выделяют нужные гены. Другой фермент – лигаза – «вшивает» гены в новую ДНК. Микроорганизмы с рекомбинантной ДНК при их выращивании производят нужный продукт.

Вначале выделенную из крови доноров и находящуюся в культуре суспензию лейкоцитарных клеток обрабатывают вирусом, оказывающим индуцирующий эффект на биосинтез интерферона. В дальнейшем из лейкоцитов получают иРНК, программирующую биосинтез интерферона. Даже в индуцированных вирусом Сендай лейкоцитах иРНК содержится не более 0,1 % (Смородинцев А.А., 1985).

С помощью фермента обратной трансриптазы (ревертазы) на полинуклеотидной основе иРНК синтезируют комплементарную ей одноцепочечную копию ДНК (кДНК). Этому этапу предшествует синтез дезоксирибонуклеотида – затравки, состоящей из 32 мононуклеотидов, которая при гибридизации взаимодействует с соответствующим комплементарным участком выделенной из лейкоцитов иРНК и в дальнейшем выступает в качестве стартовой отметки, от которой начинается РНК-зависимый синтез одной из цепей ДНК (кДНК).

На следующем этапе на отделенной от гибридной структуры ДНК –РНК одноцепочечной кДНК осуществляется биосинтез второй комплементарной цепи ДНК. Чтобы обеспечить в синтезированной к ДНК комплементарность липких концов, к ним присоединяются линкеры (переходники). Они являются синтезированными химическим путем короткими участками ДНК, имеющими разные липкие концы. Обработка рестрикционной эндонуклеазой концов кДНК, а также подобранной плазмиды вектора. Которая в результате ферментативного гидролиза расщепляется рестриктазой с образованием линейной молекулы ДНК с липкими концами, позволяет соединить кДНК с плазмидой и благодаря липким концам и с помощью ДНК-лигазы образовать кольцевидную рекомбинантную плазмиду с синтезированной кДНК, в которой находится ген, кодирующий биосинтез а-интерферона.

Затем рекомбинантную плазмиду необходимо ввести в бактериальную клетку. Следующий этап – поиск бактериальной клетки, содержащей ген интерферона. По такому признаку, как способность к гибридизации, идентифицируют бактерии, содержащие рекомбинантные плазмиды с включенным в них геном, кодирующим синтез интерферона. Эти рекомбинантные плазмиды из бактерий выделяют и с помощью рестриктаз получают гены интерферона. Эукариотический интерфероновый ген в бактериальной клетке кодирует синтез «сырого» интерферона, для превращения которого зрелый интерферон в эукариотических клетках нет необходимых условий. Для преодоления этого препятствия эукариотический ген в условиях in vitro перестраивают, удаляя соответствующей рестриктазой ту часть нуклеотидов, которые кодируют информацию, не входящую в молекулу функционального интерферона. При этом в ходе рестриктазной реакции получается «перебор». Одновременно удаляется триплет, кодирующий синтез первой аминокислоты в полипептидной цепи интерферона. Этот, а также предшествующий ему инициирующий биосинтез полипептидной цепи кодоны синтезируют химическим путем и присоединяют к гену интерферона. Созданный в результате сложных манимуляций ген переносится в плазмиду, где он совмещается с бактериальным промотором, а затем вводится в бактериальную клетку-хозяин. Таким сложным многоэтапным путем создан штамм-продуцент E.coli. В 1 л бактериальной суспензии, содержащей около 1011 клеток, концентрация а-интерферона достигает 5 мг, что в 5 тыс. раз больше того количества, которое можно получить из 1 л донорской крови.

Можно синтезировать интерферон химическим путем.

Для биотехнологического производства интерферона с выделением и очисткой ИФН, который, синтезируясь, остается в бактерии, получают моноклональные антитела к соответствующемй интерферону, прикрепляют их к полисахаридным шарикам, через слой которых пропускают после разрушения бактерий смесь белков. Интерферон взаимодействует с антителами и задерживается на полисахаридных шариках, с которых затем смывается в виде препарата высокой степени чистоты.

Имеются результаты применения человеческого интерферона против рота- и коронавирусов крупного рогатого скота в тканевой культуре и в производственных условиях на телятах (во время поения по одной желатиновой капсуле)

Биотехнология получения и использования ферментов

Получить необходимое количество ферментов за счет таких источников, как ткани растений и животных, невозможно. Единственным, неограниченным источником ферментов являются микроорганизмы, из которых можно выделить любые из известных в настоящее время ферментов. Синтезируемые микроорганизмами ферменты подразделяются на внеклеточные (гидролазы) и внутриклеточные. Скорость биосинтеза внеклеточных ферментов достаточно высокая. Продуктивность штаммов микроорганизмов, производящих ферменты, можно увеличить под действием мутагенных факторов в 2-5 раз; пересадкой плазмид получают штаммы продуцентов, количество целевого фермента в которых достигает 50% общей массы синтезируемого белка. В качестве источника углерода для микроорганизмов могут быть углеводы, спирты, карбоновые кислоты, углеводороды. Источником азота могут быть как органические (белки, пептиды, аминокислоты), так и минеральные (соли аммония, аммиак) вещества, а также атмосферный азот. Для получения препаратов ферментов культуры микроорганизмов выращивают на твердых питательных средах – поверхностный способ (Пх), на жидких питательных средах – глубинный способ (Гх) и применяют способ непрерывного культивирования.

Из культуральной жидкости, предварительно отделенной от микробных клеток, получают внеклеточные ферменты. Чтобы выделить внутриклеточные ферменты, необходимо разрушить клеточные оболочки.

Для проведения дезинтеграции клеток используются механические (баллистический, экструзионный, декомпрессионный), физические (осмотический шок, термошок, плазмолиз, замораживание –оттаивание, высушивание клеток, ультразвук, ионизирующая радиация), химические (действие кислот, щелочей, солей, органических растворителей, поверхностно-активных веществ), энзиматические (действие лизоцима, сока улитки и др. литических ферментов) и биологические (ингибирование биосинтеза клеточной оболочки, действие фагов, получение мутантных форм микроорганизмов – продуцентов ферментов с легко разрушающимися клеточными стенками) методы.

Для достижения необходимой степени чистоты ферментного препарата применяют метод разделения, основанный на неодинаковой растворимости белков. Осаждение белков без потерь их каталитической активности проводят солями неорганических кислот, например, сульфата аммония, а также органическими растворителями (этанолом, ацетоном, диоксаном, полиэтиленгликолем, декстраном). Высокая степень чистоты ферментов может достигаться с помощью хроматографии (адсорбционной, гидрофобной, ковалентной, ионнообменной, распределительной, аффинной и гель-хроматографии), проводимой на гелях агарозы, полиакриламида, целлюлозы и т.д.

Клеточная инженерия. Гибридизация в культурах клеток высших организмов разных видов.

Клеточная инженерия – метод конструирования клеток нового типа на основе культивирования, гибридизации и реконструкции.

Гибридизация – процесс образования или получения гибридов, в основе которого лежит объединение генетического материала разных клеток в одной клетке. Различают внутривидовую и отдаленную (между разными видами) гибридизацию. Гибридизация соматических клеток заключается в слиянии их ядер с образованием общего.

Сущность гибридизации соматических клеток заключается в соединении клеток с хромосомными наборами систематически далеких форм. Впервые возможность гибридизации клеток, культивируемых вне организма, установил в 1960 г. Ж.Барский. В 1965 г. Харрис обнаружил, что эффективность гибридизации соматических клеток резко повышается при обработке их инактивируемым парагриппозным вирусом Сендай. При помощи вируса Сендай, индуцированного ультрафиолетом, получены гибриды клеток многих далеких видов (мыши и курицы, мула и мыши, кролика и обезьяны, человека и курицы, коровы и норки). Из таких гибридных клеток не удается получить единый организм с суммой родительских признаков. Ученые проводят соматическую гибридизацию с целью изучения поведения разных хромосом в гибридной клетке. Способность клеток объединяться и образовывать гибриды нашла широкое применение в иммунологии (моноклональные (чистые) антитела определенной специфичности). С помощью моноклональных антител получают иммуносорбенты для производства ферментов, гормонов, интерферонов. Создаются химические «контейнеры», способные нести лекарственный препарат в определенный участок организма. Создана очень ценная гибридома на основе лимфоцитов-киллеров, обеспечивающих защиту организма от чужеродных клеток, в том числе раковых. Эти лимфоциты нападают на раковую клетку и вызывают ее гибель.

Биотехнология антител.

Как указывают В.Сюрин и В.Смоленский (1987), получение моноклональных антител открывает совершенно новые возможности не только в области диагностики заболеваний, идентификации и дифференциации возбудителей, но и при анализе структуры эпитопов вирусов, очистке антигенов, изучении иммунной системы организма, создании вакцин, получаемых посредством молекулярного клонирования или химического синтеза, при лечении некоторых вирусных болезней.

Для получения моноклональных антител против определенного эпитопа антигена после иммунизации животного необходимо соответствующую антителообразующую плазматическую клетку изолировать, а затем размножить ее в клеточной культуре. Преодолеть возникший баръер удалось созданием гибридных клеток, образующих определенные антитела.

Г.Келлер и С.Мильштейн (1975) создали в пробирочных условиях так называемую гибридому, являющуюся носителем свойств клеток, участвовавших в фузии (слиянии). Так как в качестве исходных для получения гибрида были взяты антителообразующая клетка (АОК) селезенки и быстроделящаяся раковая (миеломная) клетка, продукт слияния их обладал способностью к практически бесконечному размножению в клеточной культуре и как исходный лимфоцит – к биосинтезу одного определенного вида антител.

Среди полученных гибридом идентифицируют те клоны, которые образуют антитела определенной специфичности. Культивируют отселекционированный клон гибридомных клеток или в виде асцитной опухоли, вводя гибридомную клеточную взвесь мышам внутрибрюшинно, или в виде перевиваемой клеточной культуры. Титр моноклональных антител, содержащийся в асцитической жидкости, на 2-3 порядка превосходит то их количество, которое находится в культуральной среде. Несмотря на столь значительные расхождения в концентрации моноклональных антител, получение их в условиях клеточной культуры имеет существенные преимущества, обусловленные выделением антител из культуральной среды и последующей очисткой, а также более благоприятными условиями для контроля процесса биосинтеза.

Моноклональные антитела используются в ветеринарии для создания диагностических препаратов вирусных инфекций, а также для тестирования состава крови (клеточные популяции, иммуноглобулины и т.д.) и других биологических жидкостей.

В настоящее время созданы гибридомы, в которых происходит биосинтез моноклональных антител к антигенным детерминантам вируса венесуэльского энцефалита лошадей, африканской чумы свиней, лейкоза, бешенства, гриппа и др. Эти препараты высокочувствительны и высокоспецифичны, их можно стандартизировать. Имеются данные о повышении эффективности таких диагностикумов, как иммуноферментный анализ (ИФА), реакция пассивной гемаагглютинации, иимунофлуоресцентный метод. Иммобилизированные антитела используются в качестве иммуносорбентов, обеспечивая одноступенчатость процесса, при очистке таких биологически активных веществ, как инсулин, интерферон, соматотропный гормон и других, биосинтез которых основан на использовании технологии рекомбинантных ДНК.

Получение аллофенных животных

Аллофенными называют химерные организмы, содержащие разные ткани, произошедшие из клеток, полученных от разных родителей. Созданы аллофенные мыши путем образования смешанной бластулы из клеток черных и белых мышей. Эмбрионы мышей извлекали на стадии восьми бластомеров и с помощью фермента проназы отделяли бластомеры. Комбинируя бластомеры от двух (и более) эмбрионов, создали в специальной питательной среде единый комплексный эмбрион, который ввели в матку мыши, гормонально подготовленной к имплантации зародыша. Рождавшиеся мышата представляли собой мозаиков с признаками всех родительских форм. Были созданы мыши с крысиными клетками (гигантские мыши).

Лекция 13. Генетика онтогенеза. Медицинская генетика

Онтогенезом называется индивидуальное развитие организма, начиная от оплодотворенной яйцеклетки и заканчивая смертью. В оплодотворенной яйцеклетке соединяются гены отцовского и материнского организма, и из одной этой клетки путем многочисленных делений возникает очень сложный многоклеточный организм. Онтогенез каждой особи подчиняется биогенетическому закону Мюллера-Геккеля: сходство эмбриональных черт развития отражает степень родства разных форм в силу общности их происхождения. Для позвоночных характерно прохождение стадии, на которой у наземных форм, дышащих легкими, образуются жаберные дуги, как и у рыб. Вместе с тем, необходимо учитывать и различия в онтогенезе у разных форм, которые накладываются на общий характер развития, что свидетельствует о специфике генетической информации. Так, например, в яйцах рыб и птиц содержатся большие запасы желтка, что сказывается на их эмбриогенезе. Проявление различий между клетками в процессе эмбриогенеза называют дифференцировкой. В период дифференцировки клеток активно функционируют гены, контролирующие синтез специфических белков, необходимых для формообразовательных процессов и интеграции специализированных клеток. Основной проблемой генетики онтогенеза является выяснение вопроса о том, каким образом из одной единственной клетки возникает множество разнообразных типов клеток, значительно различающихся между собой по строению, функции и химическим особенностям, как в процессе онтогенеза идет становление признаков и свойств организма.