Опыт 1. Реакция с азотно-ртутным реактивом (реакция Миллона)

В пробирку наливают 0,5 - 1мл раствора белков и прибавляют равный объем реактива Миллона. Образуется белый осадок. Полученный осадок нагревают. Что при этом происходит?

Реактив Миллона дает окрашивание почти со всеми фенолами.

У белков реакция обусловлена присутствием в них аминокислоты тирозина или триптофана, содержащих в своем составе бензольные кольца, поэтому эту реакцию дают почти все белки, за исключением тех, молекулы которых не содержат этих аминокислот (например, желатина).

Опыт 2. Ксантопротеиновая реакция белков.

К 1 мл раствора белка в пробирке добавляют 5 – 6 капель концентрированной азотной кислоты до появления белого осадка или мути от свернувшегося под действием азотной кислоты белка. Осторожно нагревают раствор и наблюдают изменение окраски осадка. Охлаждают смесь и осторожно добавляют к кислому раствору, не взбалтывая, по каплям избыток раствора щелочи до щелочной реакции. Выпадающий в начале осадок кислотного альбумината растворяется, и жидкость меняет свою окраску. Отметьте цвет образующейся жидкости. Ксантопротеиновая реакция зависит от наличия в молекулах белков остатков ароматических аминокислот, таких как фенилаланин, тирозин. Эти аминокислоты в результате нитрования образуют желто окрашенные нитросоединения.

Желатина, не содержащая ароматических аминокислот, не дает этой реакции.

Опыт 3. Биуретовая реакция.

В пробирку наливают 1 – 1,5 мл раствора белка и добавляют равный объем раствора щелочи и затем 2-3 капли разбавленного (почти бесцветного) раствора медного купороса.

Отметьте, в какой цвет окрашивается жидкость в пробирке.

Биуретовая реакция обусловлена наличием в молекулах белка пептидных группировок

~ СO – NH ~,

т.е. эту реакцию дают все белки. Этой реакцией можно установить наличие белка при растворении его 1: 10000. Окраска возникает в результате образования комплексных соединений, содержащих медь. Свое название эта реакция получила за способность биурета, содержащего пептидную группировку: NH₂ - CO – NH – CO - NH₂, вступать в эту реакцию (но биурет не является белком!). Биурет получают путем сплавления двух молекул мочевины.

Н Н Н Н

\ ⁄ \ ⁄

N N

│ ----│-------

C=O ¦ C=O ¦ ← группа аналогична пептидной

│ ¦ │ ¦

N ¦ N-Н ¦ + NH₃

--- ⁄-- \ ----│-------

¦Н ¦ Н C=O

¦ ¦ │

¦ -------- N

¦Н Н ¦ ⁄ \

¦ \ ⁄ ¦ Н Н

¦ N ¦

-- --│-------- биурет

C=O

│

N

⁄ \

Н Н

мочевина

Опыт 4. Нингидриновая реакция.

К 1 мл раствора белка в пробирке прибавляют 4-5 капель 0,1 % раствора нингидрина, и раствор нагревают около минуты.

Отметьте цвет раствора.

Нингидриновая реакция характерна для α - аминокислот, поэтому она получается и с белками, содержащими в своей молекуле карбоксильные и α - аминогруппы.

H O H OH

│ ║ │ │

C C C C

R ⁄ ⁄ \ ⁄ \ O ⁄ ⁄ \ ⁄ \ \

│ HC C ║ HC C

HC – NH₂ + │ ║ C=O + H₂O C + CO₂ + │ ║ C ─ OH + NH₃

│ HC C ⁄ ⁄ \ HC C ⁄

COOH \\ ⁄ \ R H \\ ⁄ \

C C C C

│ ║ │ ║

H O H O

α-амино- + нингидрин + вода = альдегид + углекислый + восстановленный + аммиак

кислота газ нингидрин

Восстановленный нингидрин, конденсируясь с аммиаком и окисленной молекулой нингидрида, образует раствор, который имеет фиолетово–синюю окраску.

H O H OH

│ ║ │ │

C C C C

⁄ ⁄ \ ⁄ \ ⁄ ⁄ \ ⁄ \ \

HC C HC C

│ ║ C=O + │ ║ C ─ OH + NH₃

HC C ⁄ HC C ⁄

\\ ⁄ \ \\ ⁄ \

C C C C

│ ║ │ ║

H O H O

H O O H

│ ║ ║ │

C C C C

⁄ ⁄ \ ⁄ \ \ ⁄ \ ⁄ \ \

HC C C CH

│ ║ C ─ N = C ║ │

HC C ⁄ C CH

\\ ⁄ \ \ ⁄ \ ⁄⁄

C C C C

│ ║ ║ │

H O O H

(Раствор фиолетово-синей окраски).

Лабораторная работа 3

Определение аминного азота медным способом

Количественное определение α - аминного азота аминокислот и пептидов наряду с другими методами можно осуществить сравнительно просто так называемым медным способом. Сущность этого метода состоит в том, что α – аминокислоты и пептиды способны образовывать комплексные растворимые соединения с ионами двухвалентной меди, которые в дальнейшем определяют изометрическим методом.

Испытуемый раствор смешивают при слабощелочной реакции с избытком суспензии фосфорнокислой меди в боратном буферном растворе. Раствор хорошо перемешивают.

Медь образует при этом с аминокислотами и пептидами растворимые внутрикомплексные соли. Избыток фосфата меди отфильтровывают и в полученном прозрачном растворе разлагают медные комплексные соли, действуя на них йодистым калием в кислой среде. При этом происходит восстановление меди и выделяется свободный йод, который оттитровывают тиосульфатом натрия.

При этом протекают следующие реакции:

СO – O NH₂ - CH₂

⋰

2 Cu + 4 HI → 2 CuI + I₂ + 4NH₂- CH₂ - COOН

⋰

CH₂- NH₂ O - CO

I₂ + 2 Na₂S₂O₃ → Na₂ S₄O₆ + 2NaI

Оборудование и реактивы: колбы мерные по 25 мл - 2 штуки, пипетки на 2 мл – 1 шт.,

на 10 мл – 3 шт., бюретка на 20 – 50 мл, воронка для фильтрования, фильтры, конические колбы на 50 мл – 2 шт., раствор хлорной меди (27,3 г в 1 л раствора), трехзамещенный фосфат натрия (68,5 г (Na₃PO₄ ⋅ 12 H₂O) в 1 л раствора), боратный буферный раствор (28,6 г буры растворяют в 750 мл воды, добавляют 50 мл 1н раствора HCl и добавляют водой до 1 л), суспензия фосфорнокислой меди (смешивают один объем хлорной меди с двумя объемами трехзамещенного фосфата натрия и приливают два объема боратного буфера), тимолфталеин (0,25 г тимолфталеина в 100 мл 50% этилового спирта), 0,1н раствор тиосульфата натрия (Na₂S₂O₃ ⋅ 5 H₂O), 1% раствор крахмала, раствор иодистого калия (10г в 100 мл раствора), концентрированная уксусная кислота, 0,5н раствор гидроксида натрия, 1% раствор глицина.

Порядок выполнения работы

В мерную колбу на 25 мл берут 2 мл исследуемого раствора (1% раствор глицина). Добавляют 2 капли фенолфталеина и по каплям прибавляют раствор едкого натра до слаборозового окрашивания, (т.е. доводят рН раствора до 10,2). После этого добавляют 10 мл суспензии фосфата меди и хорошо перемешивают. Если вся суспензия фосфата меди входит в реакцию (на что указывает отсутствие осадка – избытка фосфата меди), следует добавить еще 5 мл суспензии. Колбу доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают многократным переворачиванием колбы и отфильтровывают избыток фосфата меди через плотный фильтр. Фильтрат должен быть совершенно прозрачным. Из фильтрата берут две пробы по 10 мл в конические колбы для титрования, подкисляют 0,5 мл концентрированной уксусной кислоты, добавляют 5 мл раствора йодистого калия и выделившийся йод титруют 0,01 н раствора тиосульфата натрия. Крахмал добавляют в тот момент, когда раствор примет соломенно-желтую окраску, в количестве 0,1 –0,2 мл (2 - 4 капли). Титрование продолжают до исчезновения появившейся синей окраски. По окончании процесса титрования отмечают количество мл тиосульфата натрия, пошедшего на титрование 10 мл пробы. Необходимо также проделать холостой опыт, в котором вместо раствора глицина берется такой же объем дистиллированной воды и все остальные операции проводятся также, как и в случае раствора аминокислоты. Если на титрование холостого опыта затрачивается какое-то количество мл тиосульфата натрия, то это его количество вычитают из найденного для опытного раствора. По уравнению реакции 1 атом выделившегося йода соответствует 1 атому меди, а атом меди соответствует 2 атомам или 28 г аминного азота. С другой стороны, 1 атом йода реагирует с другим эквивалентом тиосульфата натрия, следовательно, 1 эквивалент тиосульфата натрия соответствует 28 г аминного азота. Отсюда, 1 мл 0,01 н раствора тиосульфата натрия отвечает 0,28 мг аминного азота. Умножением величины 0.28 мг на затраченный объем 0,01 н раствора тиосульфата натрия получают количество мг аминного азота во взятом объеме пробы (10мл). после этого делают перерасчет на весь объем раствора в колбе (25мл) и сравнивают найденное количество аминного азота с теоретическим количеством содержащимся в 2 мл исследуемого раствора глицина.