Принцип создания векторных систем на основе фага λ

Для того чтобы осуществить клонирование, необходимо получить клон клеток одного штамма, одного типа. Клонирование гена сводится к получению неких биологических организмов, в составе которых будут эти клонируемые гены. Получается клон, каких - то организмов, в частности либо бактериальные клетки, чаще всего, либо вирусы, в составе которых будут находиться определённые гены, нужные экспериментатору и таким образом получается клон организма, содержащего эти гены. Для простоты говорят, получается клон генов. Гены сами по себе не репродуцируются и должны быть в каких-то системах, которые обеспечивают репликацию, а если нужно, то и экспрессию.

Для осуществления клонирования генов требуются так называемые векторные системы, которые представляют из себя какие-то биологические структуры, способные реплицироваться в том или ином организме и обеспечивают репликацию вставленных в них чужеродных генов. Такими структурами должны быть молекулы, которые способны при введении в клетки там длительно существовать. Только в этом случае можно получить клон этих организмов, и естественно включенные в эти организмы гены. Такими образованиями являются те молекулы, которые способны существовать в клетке и воспроизводиться в клетке.

При создании первых векторных систем было обращено внимание на фаг λ. Фаг λ может встраиваться в хромосому и существовать в хромосоме бактериальной клетки неограниченно длительное время. Если в фаг λ вставить какую-нибудь чужДНК фрагмент, то вместе с геномом фага в состоянии профага будет воспроизводиться, реплицироваться этот вставленный чужеродный фрагмент ДНК. Если использовать рестриктазы для того чтобы порезать фаговые геномы и соединить фрагмент фагового генома с геномом чужДНК, рестриктазы казались непригодными, в силу того, что геном фага имеет много сайтов для разрезания. Идеальный вектор может быть таким, который содержит уникальные сайты для рестриктаз. Для какой-то одной рестриктазы – один сайт, для другой – тоже один сайт. Тогда можно использовать данный объект в качестве возможного вектора. Ибо если много одинаковых сайтов, то при разрезании данной рестриктазой, этот вектор будет рассыпаться и собрать его в таком виде, чтоб он мог реплицироваться врятли тогда удастся. Правда из фага λ можно удалять отдельные сайты, и их количество, но при поиске других каких-то возможностей, оказалось, что более подходящими являются плазмиды как векторы, ибо плазмиды меньше молекулы ДНК, чем геном фага λ и возможно подобрать плазмиду, которая содержит уникальные сайты. То есть сайты для различных рестриктаз. Если плазмиду порезать какой-то рестриктазой и этой же рестриктазой нарезать чужДНК, потом это смешать, то в силу случайных контактов может возникнуть рекомбинантные химерные молекулы. Тем не менее, в последующем оказалось, что фаги могут использоваться в качестве векторных систем. В геноме фага, имеется так называемая жизненно неважная область, в смысле эта область генома не требуется для осуществления литического цикла. И эту область можно удалить и в место данной области вставить некую другую. Но для этого надо удалить все возможные сайты для других рестриктаз, оставить только те которые обеспечивают разрезание допустим фагового генома на три части, из которых одну можно удалить, нежизненно важную область и вместо ее вставить соответствующий по размерам чуж. формат и тогда такая химерная структура, если ее ввести в клетки кишечной палочки путем трансформации (трансфекции). Обработать клетку таким образом, чтобы она могла воспринять ДНК.

Кишечная палочка в естественных условиях не трансформабильна, ее надо ввести в состояние компетенции, соответствующими оборотами (хлористым кальцием). Фаги можно использовать в качестве вектора в силу того, что природа сделала такую штуку, что фрагмент ненужный для литического цикла можно удалить. Фаг способен репродуцироваться, если размер генома его будет либо105%, то есть 105% больше естественного размера, либо не менее 75%. Если с генома удалить количество ДНК, в результате которого удаления останется меньше 75% генома, то такой фрагмент не упакуется в ДНК-овую оболочку фага, и фаг не может репродуцироваться. Значит можно, если удалить не существенную область, то можно получить молекулу ДНК составленную с фаговым геномом или чужДНК размером 105% полного генома и такая структура сможет обеспечить размер фага.

Крис Томас, 1975г. и некоторые другие авторы создали набор фаговых векторов, созданных на основе фага λ. Векторы, которые были созданы на основе фага λ были подразделены на 2-е категории, на так называемые вставочные векторы и замещающие векторы.

Вставочные векторы готовятся из генома фага λ из которого предварительно удаляется часть генома, не требующаяся для литического развития. И вот в такой уменьшенной форме, частично делетированный геном, имеющий уникальный сайт для какой-то рестриктазы, может использоваться в качестве, так называемого вставочного вектора. Уникальный сайт вставляется в определённый сегмент чужДНК, но размер этого сегмента не должен превышать размер сегмента, который потом будет включаться, будет участвовать в репликации и репродукции фага.

И замещающие векторы, когда из генома предварительно, опять же, перед созданием химерной молекулы для клонирования, удаляется часть генома и эта часть замещается фрагментом чужДНК. Вот на этой картинке представлено схематически функционирование типичного вектора созданного на базе фага λ. Что это за вектор тут не указано, но это не так уж и важно. Геном фага λ имеет 2 сайта, которые локализованы таким образом, чтобы после воздействия рестриктазой появился фрагмент который можно удалить из нежизненно важной области фагового генома. EPR Ι рестриктаза даёт липкие концы, она режет в определенных сайтах ступенчатообразно любую молекулу ДНК, где есть такие последовательности. Режется фаг рестриктазой EPR Ι и появляется 3 фрагмента: левое плечо, правое плечо и средняя часть, которая включает нежизненно важную часть генома. С помощью различных манипуляций удаляется эта вырезанная часть и остаётся левое и правое плечо для участия в геноме. Этой же рестриктазой режется чужДНК и возникает комплементарные липкие концы, затем смешиваются оставшиеся части генома фага и фрагменты нарезаные чужДНК. Смесь подвергают лигированию (или как говорят отжигу) в течении которого могут соединяться эти липкие концы. Естественно всё это происходит случайно и эффективность формирования нужного по размерам ДНК достаточна высока. Во всяком случае, в такой смеси добавляется лигаза, появляются конкатемерные молекулы, которые включают cos -сайты. Конкатемеры несут встроенный фрагмент чужДНК, затем такой химерной молекулой трансформируют соответствующие клетки, где может происходить нарезание этих фрагментов, где могут происходить транскрипция соответствующих генов, репликация соответствующих участков.

В принципе, эффективность такой процедуры не очень высока.

Введение lac – гена сделано в качестве метки позволяющей определить встроился в вектор чужеродный сегмент или нет. Если чужеродный сегмент встроится, то ген lac будет инактивирован. Но это не весь lac- локус, а только β-галактозидаза. И по активности β-галактозидазы можно потом, в последующем определять встроилось что-то или нет. Есть специальное соеденение x-gal, субстрат для β-галактозидазы, и если lac⁺ клетку выбросить на среду, где есть это соединение, то будут появляться синего цвета, голубого цвета бляшки. За счёт того, что β-галактозидаза будет x-gal. Я не буду точно говорить, как точно называется это соединение, за счёт его фрагментирования сменяется окраска бляшки. Значит ген lac(w), если же он инактивирован, этот lac-Z ген, то будут бесцветные бляшки, но когда использовали этот вектор, хоронный вектор. Так вот, если таким фаговым вектором потом заражать клетки, то если здесь будет вставка, то будут бесцветные бляшки. Если вставка не возникнет, то -синие. Поэтому можно отбирать уже фаги, которые будут нести встроенный ген. Вот это замещающие векторы-2 –а. Здесь имеется одна делеция, делеция вторая и 2-а сайта для EPRI и 2-а сайта для SST- 1. По этим сайтам можно встраивать чуж.фрагменты. Этот чуж. фрагмент может быть большего размера, т.к. здесь имеется 2-е делеции так что до 105%, генома можно встраивать в ДНК. Вот это замещающие векторы, а это вставочные векторы. Замещающие векторы и вставочные векторы несут 2-е амбер - мутации. Значит эти векторы могут использоваться в лаборатории только с амбер - супрессорными штаммами, которые супрессируют данные мутации и позволяют реплицироваться химерным молекулам при введении в клетки.

Вводятся амбер - мутации, ибо амбер - мутанты в природе не могут найти себе хозяина. Если использовать в качестве средства для клонирования соответствующие бактерии киишечной палочки и фаговый вектор, и вводить химерную молекулу, созданную на основе этого фагового вектора путем трансформации (введение голой ДНК в клетку, то эффективность очень мала, где-то 10⁵ бляшек на 1мкг ДНК. Это очень низкая эффективность. Это если нативный фаговый геном будет вводиться в клетку. А если еще химерная молекула, то эффективность снижается еще на порядок. Решили сделать систему таким образом, чтобы упаковать химерную молекулу в белковую оболочку фагаλ и уже таким фагом заражать клетки. Это существенно повышает эффективность. Но для этого надо сделать так называемую упаковачную систему. С помощью ее можно с помощью фага λ клонировать гены эукариотических организмов и бактериальных систем.

Упаковачная система. Режется векторная ДНК, удаляется жизненно неважная область, режется этой же рестриктазой эукариотическая клетка, смешивается порезанная ДНК. Порезанная ДНК после удаления жизненно неважной области, и там случайно могут возникать такие структуры, которые включают фрагмент эукДНК и по размерам подходящие для упаковки фаговой оболочки. Добавляется упаковачная система, формируются фаги трансдуцирующие.