Холестерол-

эстераза

¾¾¾¾®

H₂O

R―COOH

холестерид холестерол

Общий (свободный и образовавшийся в результате гидролиза) холестерол окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества пероксида водорода:

холестерол-

оксидаза

¾¾¾¾®

O₂ H₂O₂

холестерол холестерон

В присутствии пероксидазы пероксид водорода окисляет фенол с образованием бензохинона, окрашенного в розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству холестерола в пробе:

O

пероксидаза

2 Н₂О₂ + ¾¾¾¾¾® + 3 Н₂О

OH O

фенол бензохинон

Ход работы

В три пробирки приливают реактивы в следующей последо-вательности: в первую (опыт) – 0,02 мл сыворотки или плазмы крови, во вторую (стандарт) – 0,02 мл стандартного раствора холестерола, содержащего 5,17 ммоль/л (т.е. 200 мг%) и в третью (контроль) – 0,02 мл дистилированной воды.

Во все три пробирки наливают по 2 мл рабочего реагента, содержащего ферменты и фенол. Пробы помещают в термостат на 10 минут при 37 ^оС. Затем опытную и стандартную пробы колориметрируют на ФЭКе против контроля в кюветах на 3 мм при длине волны 490-500 нм.

Оформление работы

1. Рассчитайте количество холестерола в исследуемой пробе по формуле:

С = Е_о/Е_ст. ´ 5,17 [ммоль/л] или

С = Е_о/Е_ст. ´ 200 [мг%],

где Е_о – экстинкции опыта,

Е_ст. – экстинкция стандарта,

С – количество общего холестерола.

2. Сравните полученные результаты с нормой и сделайте выводы.

Количество общего холестерола в сыворотке крови здоровых людей разного возраста равно:

20-29 лет – 3,72-7,11 ммоль/л (144-175 мг%),

30-39 лет – 4,27-7,63 ммоль/л (165-295 мг%),

40-49 лет – 4,40-8,15 ммоль/л (170-315 мг%),

старше 50 лет – 4,58-8,79 ммоль/л (177-340 мг%).

работа 18. количественное определение холестерола липопротеинов высокоЙ плотности в сыворотке крови энзиматическим методом

Принцип метода. Хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеины низкой плотности (ЛПНП) осаждаются фосфорновольфрамовой кислоты и Mg²⁺. После центрифугирования в супернатанте остаются только липопро-теины высокой плотности (ЛПВП), содержание холестерола в которых определяется энзиматическим методом, как концентра-ция общего холестерола.

Ход работы

1. Берут три центрифужные пробирки и наливают: в первую пробирку (опыт) 0,15 мл сыворотки крови, во вторую (стандарт) – 0,15 мл стандартного раствора, содержащего 1,29 ммоль/л (т.е. 50 мг%) холестерола, и в третью (контроль) – 0,15 мл дистил-лированной воды

Во все пробирки добавляют по 0,3 мл осаждающего реагента (раствора фосфорновольфрамовой кислоты). Содержимое проби-рок тщательно перемешивают и оставляют на 10 минут при комнатной температуре (20-25 ^оС). Затем опытную пробирку центрифугируют в течение 15 минут при 3000 об./мин. Прозрач-ный центрифугат сливают в чистую центрифужную пробирку. Стандарт и контроль можно не центрифугировать.

2. В три обыкновенные пробирки (опыт, стандарт и контроль) осторожно переносят автоматической пипеткой по 0,2 мл надосадочной жидкости из соответствующих центри-фужных пробирок. Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента для определения общего холестерола. Реакционную смесь тщательно перемешивают, и пробы помещают в термостат на 10 минут при 37 ^оС. Затем опыт и стандарт колориметрируют на ФЭКе против контроля в кюветах с толщиной поглощающего слоя 3 мм при длине волны 490-500 нм.

Оформление работы

1. Рассчитайте количество холестерола липопротеинов высокой плотности (a-холестерола) в исследуемой пробе по формуле:

С = Е₀/Е_ст. ´ 1,29 [ммоль/л] или

С = Е₀/Е_ст. ´ 50 [мг%],

где Е₀ – экстинкция опыта,

Е_ст. – экстинкция стандартного раствора,

С – количество a-холестерола.

2. Рассчитайте холестериновый индекс атерогенности (ХИА) по формуле:

ХИА = (количество общего холестерола – количество µ-холестерола) / количество µ-холестерола

В норме величина холестеринового индекса атерогенности £ 3,0.

3. Проанализируйте полученные результаты и сделайте вывод.

Работа 19. Анализ желудочного сока

Желудочный сок – секрет желез слизистой оболочки желудка. Это прозрачная бесцветная или желтоватая жидкость с резко кислой реакцией (рН=1,0-2,0). За сутки у человека выделяется около 1,5 литра желудочного сока. В состав желудочного сока входят вода, ферменты (пепсин, гастриксин), муцин, транскоррин, гастрин, соляная кислота, хлорид натрия, однозамещенные фосфаты.

А. Качественные исследования желудочного сока

Кислые компоненты желудочного сока можно обнаружить с помощью различных индикаторов (синего лакмуса, конго-рот, диметиламиноазобензола).

1. Реакция с синим лакмусом

Ход работы. Одну каплю желудочного сока наносят стеклянной палочкой на синюю лакмусовую бумажку. Появле-ние красного цвета свидетельствует о кислой реакции желудоч-ного сока.

2. Реакция с индикатором конго-рот

Зона перехода окраски конго красного находится при рН=3,0-5,2. В сильно кислой среде (рН < 3,0) окраска индика-тора синяя, при рН > 5,2 – красная. В присутствии свободной соляной кислоты конго-рот окрашен в синефиолетовый цвет. В отсутствии соляной кислоты красный цвет индикатора не меняется, так как другие кислореагирующие вещества желудоч-ного сока присутствуют в небольшом количестве и создают рН выше 4,0.

Ход работы. В одну пробирку вносят 10 капель исследуемого желудочного сока, а в другую – 10 капель 0,2%-го раствора HCl. В обе пробирки прибавляют по 2 капли 0,1%-го спиртового раствора конго-рот и отмечают изменение окраски.

Эту же реакцию можно проделать нанеся стеклянной палоч-кой по капле желудочного сока и 0,2%-го раствора НСl на кусочки индикаторной бумажки конго.

3. Реакция с пара-диметиламиноазобензолом

Зона перехода окраски диметиламиноазобензола находится в пределах рН=2,9-4,2; при рН < 2,9 окраска индикатора ярко-красная, при рН > 4,2 – желтая.

Ход работы. В одну пробирку наливают 10 капель желудочного сока, а во вторую – 10 капель 0,2%-го раствора НСl. В обе пробирки добавляют по 1-2 капли 0,5%-го спиртового раствора диметиламиноазобензола и отмечают изменение окраски.

4. Качественная реакция Уфельмана на молочную кислоту

Молочная кислота, конечный продукт брожения, появляется в желудочном соке с низким содержанием соляной кислоты или при полном ее отсутствии. При наличии в соке молочной кислоты фиолетовая окраска реактива Уфельмана изменяется на желтую или желто-зеленую вследствие образования лактата железа. Реактив Уфельмана – комплексное соединение фенолята железа, образующееся при взаимодействии фенола с хлоридом железа:

а) НО- ¾¾¾¾¾¾® (С₆Н₁₀О)₃Fe

FeCl₃ 3 HCl фенолят железа

фенол (фиолетовый цвет)

б) СН₃ ОН СН₃

½ ½ ½

3 СНОН + (С₆Н₁₀О)₃Fe ¾® 3 + СНОН

½ ½

СООН СООFe

фенолят железа

лактат фенол лактат железа

(желто-зеленого

цвета)

Если концентрация соляной кислоты в желудочном соке близка к нормальной (0,2-0,5%) или выше ее, жидкость обесцвечивается, так как сильная соляная кислота разрушает комплекс железа с фенолом и вытесняет молочную кислоту из ее соли. Реакция на молочную кислоту в этом случае отрицательна.

Ход работы

а) Готовят реактив Уфельмана: к 1 мл 1%-го раствора фенола добавляют 2-3 капли 1%-го раствора хлорида железа (III) до появления фиолетовой окраски.

б) К приготовленному реактиву Уфельмана добавляют по каплям желудочный сок до изменения окраски.

5. Бензидиновая проба на кровь в желудочном соке

Кровь появляется в желудочном соке при изъязвлении сте-нок и раке желудка.

Реакция с бензидином основана на окислении его кислоро-дом, образующимся при разложении пероксида водорода в присутствии крови.

Ход работы. К 1 мл желудочного сока добавляют 4-5 капель 0,2%-го спиртового раствора бензидина и 5 капель 1%-го раствора перекиси водорода. При наличии крови раствор окра-шивается в синий цвет.

6. Исследование действия пепсина желудочного сока

Пепсин – эндопептидаза с оптимумом рН действия 1,5-2,5. Пепсин расщепляет белки до полипептидов, которые могут быть обнаружены с помощью биуретовой реакции. В слабо щелочной среде и при инактивации пепсина расщепление белка не происходит.

Ход работы

а) В три пробирки наливают по 1 мл желудочного сока. Содержимое первой пробирки кипятят в течение 2 минут (для денатурации пепсина) и охлаждают под струей воды. Желудоч-ный сок во второй пробирке нейтрализуют раствором бикарбо-ната натрия до слабощелочной реакции по универсальной индикаторной бумажке (3-4 капли 10%-го раствора NаНСО₃). Содержимое третьей пробирки оставляют без изменения.

б) Во все пробирки добавляют немного (50-100 мг) сухого белка (фибрина или яичного альбумина). Пробирки помещают в термостат при 37 ^оС на 30 минут, после чего содержимое каждой пробирки встряхивают и отмечают изменение белка (растворение, набухание).

в) Для обнаружения продуктов ферментативного гидролиза делают биуретовую реакцию: во все пробирки наливают по 1 мл 10%-го раствора гидроксида натрия и по 1-2 капли 1%-го раствора сульфата меди.

Б. Количественное определение кислотности

желудочного сока

Кислотность желудочного сока определяют по количеству миллилитров 0,1 н раствора гидроксида натрия, пошедшему на титрование 100 мл желудочного сока. При этом определяют общую кислотность желудочного сока и кислотность, которую создают свободная, связанная и общая соляная кислота.

Общая кислотность представляет сумму всех кислореаги-рующих веществ желудочного сока (свободная соляная кислота, связанная соляная кислота, кислые однозамещенные фосфаты, органические кислоты). У здорового взрослого человека общая кислотность желудочного сока составляет 40-60 титрационных единиц (Е), из них 20-40 Е приходится на свободную соляную кислоту. Под связанной соляной кислотой понимают кислореа-гирующие хлористые соли белков. Эта кислотность в норме колеблется от 2 до 15 Е. Общая соляная кислота равна суммар-ному количеству свободной и связанной HCl.

При заболеваниях желудка кислотность желудочного сока может быть повышенной, пониженной и нулевой. При язвенной болезни желудка и гиперацидном гастрите происходит увеличе-ние содержания свободной соляной кислоты и общей кислот-ности (гиперхлоргидрия). При гипоацидном гастрите, опухолях желудка наблюдается уменьшение количества свободной соля-ной кислоты и общей кислотности (гипохлоргидрия). При хроническом анацидном гастрите, раке желудка отмечаются полное отсутствие свободной соляной кислоты и резкое снижение общей кислотности (ахлоргидрия). При злокачест-венном малокровии и раке желудка секреция желудочного сока может полностью прекратиться, в связи с чем в желудочном содержимом отсутствует соляная кислота и пепсин (ахилия).

При отсутствии свободной соляной кислоты в желудке появляются продукты брожения (молочная, уксусная, масляная кислоты).

Для определения общей кислотности используют индикатор фенолфталеин. Свободную соляную кислоту определяют в присутствии индикатора диметиламиноазобензола. Сумму всех кислореагирующих веществ желудочного сока, кроме связанной соляной кислоты, можно установить титрованием в присутствии индикатора ализарингидросульфоната натрия. Возможно также определение разных видов кислотности в одной пробе желудоч-ного сока в присутствии двух индикаторов: фенолфталеина и диметиламиноазобензола.

1. Определение общей кислотности желудочного сока

Ход работы. В колбочку наливают 5 мл желудочного сока и добавляют 1-2 капли 1%-го спиртового раствора фенолфта-леина. Содержимое колбочки титруют 0,1 н раствором гидрок-сида натрия до появления устойчивого красного цвета. Отме-чают объем щелочи, пошедшей на титрование.

2. Определение свободной соляной кислоты

При титровании в присутствии индикатора диметиламино-азобензола нейтрализуется только свободная соляная кислота, так как слабые органические кислоты, кислые фосфаты и связанная соляная кислота в присутствии сильной соляной кислоты находятся в недиссоциированном состоянии и в реакцию со щелочью не вступают.

Ход работы. В колбочку вносят 5 мл желудочного сока, 1-2 капли 0,5%-го спиртового раствора диметиламиноазо-бензола и титруют красный раствор до перехода окраски в оранжевую (желто-розовую). Отмечают объем щелочи, пошед-шей на титрование.

3. Определение суммы кисло-реагирующих веществ желудочного сока, кроме связанной соляной кислоты

Ход работы. В колбочку вносят 5 мл желудочного сока, 1-2 капли 1%-го водного раствора ализарингидросульфоната натрия и титруют 0,1 н раствором гидроксида натрия до изменения желтой окраски раствора на фиолетовую. Отмечают пошедший на титрование объем щелочи.

4. Определение общей кислотности, общей, свободной и связанной соляной кислоты в одной порции желудочного сока

Ход работы. В колбочку наливают 5 мл желудочного сока, добавляют 1 каплю 0,5%-го спиртового раствора диметиламино-азобензола и 2 капли 1%-го спиртового раствора фенолфта-леина. При наличии в соке свободной соляной кислоты раствор окрашивается в красный цвет. Содержимое колбочки титруют сначала до перехода окраски в оранжевую (1-й пункт титро-вания), затем до перехода окраски в лимонно-желтую (2-й пункт титрования) и далее – до появления красного цвета (3-й пункт титрования). Каждый раз при изменении окраски отмечают количество щелочи, пошедшее на титрование.

Оформление работы

1. Отразите результаты качественного исследования желудочного сока в таблице:

№	Проба	Кислотност	ь желудочного	сока
п/п		нормальная	повышенная	пониженная	нулевая
1.	На синий лакмус
2.	На конго-рот
3.	С ДМААБ
4.	Уфельмана
5.	Бензидиновая

2. Результаты исследования действия пепсина оформите в виде таблицы:

Параметры		№ пробирок
Субстрат
Состояние ферментов
Реакция среды
Видимые изменения
Биуретовая реакция
Выводы

3. Рассчитайте различные виды кислотности (в титрацион-ных единицах), определенные в отдельных порциях желудоч-ного сока:

а) общая кислотность желудочного сока = количество 0,1 н раствора NаОН (в мл), пошедшее на титрование, умноженное на 20;

б) свободная НСl = количество 0,1 н раствора NаОН (в мл) х 20;

в) кислотность всех кислореагирующих веществ, кроме связанной НСl = количество мл 0,1 н раствора NаОН х 20;

г) связанная НСl = общая кислотность желудочного сока – кислотность всех кислых продуктов (кроме связанной НСl);

д) общая HCl = свободная НСl + связанная НСl.

4. Рассчитайте процентное содержание свободной соляной кислоты исходя из того, что 1 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия эквивалентен 0,00365 г НСl:

Концентрация свободной НСl (%) = А х 0,00365 х 20,

где А – количество 0,1 н раствора NаОН (в мл), пошедшее на титрование.

Сравните полученные результаты с нормой.

5. Рассчитайте различные виды кислотности желудочного сока (в титрационных единицах) по результатам титрования одной порции желудочного сока в присутствии двух индикаторов (фенолфталеина и диметиламиноазобензола):

а) свободная НСl = количество 0,1 н раствора NаОН (в мл) до 1 пункта титрования х 20;

б) общая НСl = среднее арифметическое между 2- и 3-м пунктами титрования х 20;

в) связанная НСl = общая НСl – свободная НСl;

г) общая кислотность = количество 0,1 н раствора NаОН (в мл) до 3-го пункта титрования х 20.

Результаты титрования и расчетов оформите в виде таблицы:

Пара	метры	Кислотность желудочного сока
		нормальная	повышенная	пониженная	нулевая
Количество 0,1 н р-ра	до 1-го пункта
NaOH (мл), пошедшее	до 2-го пункта
на титрование	до 3-го пункта
Количество	свободная HCl
HCl (%)	общая HCl
	связанная HCl
Общая кисл	отность

Техника безопасности

· Соблюдайте правила наполнения бюреток.

· Не нарушайте правила техники безопасности при наливании реактивов и использовании градуированных пипеток.

Работа 20. Контрольные задачи на исследование желудочного сока

Ход работы. Проведите анализ предложенных вам 2-4 желудочных соков и результаты каждого анализа оформите в виде протокола:

Биохимический анализ желудочного сока №

1. Дата исследования………………………………………..

2. Цвет………………………………………………………..

3. Прозрачность………………………………………….…..

4. Запах……………………………………………………….

5. Реакция на синий лакмус…………………………………

6. Реакция на конго-рот………………………………….…..

7. Реакция на диметиламиноазобензол……………………..

8. Реакция Уфельмана………………………………………..

9. Реакция на кровь……………………………………….….

10. Результаты титрования 5 мл желудочного сока 0,1н. NаОН:

а) до оранжевого цвета …… мл 0,1 н р-ра NаОН

б) до лимонно-желтого цвета ……мл 0,1 н р-ра NаОН

в) до розово-красного цвета ……...мл 0,1 н р-раNаОН

11. Кислотность желудочного сока:

а) свободная соляная кислота ………………………….

б) связанная соляная кислота ………………………….

в) общая соляная кислота……………………………….

г) общая кислотность……………………………………

12. Выводы: ……………………………………………………

Работа 21. Количественное определение активности аминотрансфераз

в крови по методу Кинга

Аминотрансферазы – ферменты, катализирующие реакции обратимого переноса a-аминогруппы аминокислоты на кето-кислоту. Определение активности аминотрансфераз имеет большое диагностическое значение. В норме процесс трасами-нирования происходит в скелетной и сердечной мышцах, почках, семенниках и особенно активно в печени, поэтому активность аминотрансфераз в этих тканях высокая, в сыворотке крови она значительно ниже. При нарушении целостности клеточных мембран аминотрансферазы поступают из тканей в кровь, поэтому определение их активности в сыворотке крови является важным тестом для диагностики инфаркта миокарда, вирусного гепатита, цирроза печени и других заболеваний.

Принцип метода. Метод Кинга основан на способности щавелевоуксусной и пировиноградной кислот – конечных продуктов трансаминирования, реагировать с 2,4-динитро-фенилгидразином с образованием окрашенных динитрофенил-гидразонов. Например, при переаминировании аспарагиновой кислоты образуется оксалацетат (щавелевоуксусная кислота), который реагирует с 2,4-динитрофенилгидразином:

а) COOH COOH COOH COOH

½ ½ ½ ½

CH₂ CH₂ CH₂ CH₂

½ ½ ½ ½

CHNH₂ + CH₂ ¾¾® C=O + CH₂

½ ½ ½ ½

COOH C=O СOOH CHNH₂

½ ½

COOH COOH

аспарагиновая a-кето- щавелево- глутаминовая

кислота глутаровая уксусная кислота

кислота кислота

б) COOH COOH

½ ½

CH₂ NO₂ CH₂ NO₂

½ ½ ½ ½

C=O + H₂N-NH- ¾® C= N - NH -

½ H₂O ½

COOH NO₂ COOH NO₂

щавелевоуксусная 2,4-динитро- динитрофенилгидразон

кислота фенилгидразин щавелевой кислоты

Ход работы. В одну пробирку (опытная проба) вносят микропипеткой 0,2 мл сыворотки крови, а в другую (контроль) – 0,2 мл дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 0,5 мл 2%-го раствора аспарагиновой кислоты и 0,5 мл 0,6%-го раствора a-кетоглутаровой кислоты. Содержимое каждой пробирки перемешивают, и пробы помещают в термостат на 60 минут при 37 ^оС. Затем в пробирки наливают по 1 мл 0,1 %-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина, перемешивают и снова ставят на 15 минут в термостат. По окончании инкубирования в обе пробирки добавляют по 10 мл 0,4 н раствора гидроксида натрия. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на 2-3 минуты для развития коричнево-красной окраски. После чего измеряют оптическую плотность опытной пробы против контроля в кюветах на 10 мм при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм).

Оформление работы

Рассчитайте активность аспартатаминотрансферазы в услов-ных единицах, умножив величину оптической плотности на 100.

У здоровых людей активность аспартатаминотрансферазы сыворотки крови составляет 10-35 условных единиц.

Техника безопасности

· Соблюдайте правила работы на фотоэлектроколориметре.

· Соблюдайте правила пользования термостатом.

Работа 22. Качественные реакции на некоторые гормоны

Гормоны – биологически активные органические соедине-ния, участвующие в регуляции обмена веществ.

Качественные реакции на инсулин

Инсулин – низкомолекулярный простой белок, синтези-руемый b-клетками островковой ткани поджелудочной железы. Качественные реакции, характерные для белков, подтверждают белковую природу инсулина.