Главная Случайная страница Контакты | Мы поможем в написании вашей работы! | ||
|
Активность щелочной фосфатазы в норме равна 0,5-1,3 ммоль/ч×л, а кислой фосфатазы – 0,06-0,13 ммоль/ч×л. Принцип определения активности фосфатаз основан на способности ферментов отщеплять неорганический фосфат от b-глицерофосфата. Для определения активности щелочной фосфатазы используют щелочной раствор b-глицерофосфата, для кислой – кислый раствор b-глицерофосфата.
Реактивы и исследуемый материал
1. Щелочной раствор b-глицерофосфата, 5 г/л, рН 8,6. 2. Кислый раствор b-глицерофосфата, 5 г/л, рН 5,0. 3. Раствор молибденовокислого аммония, 25 г/л (в 2,5 н растворе серной кислоты). 4. Раствор трихлоруксусной кислоты, 100 г/л. 5. Рабочий стандартный раствор фосфора (содержит 0,01 мг фосфора в 1 мл). 6. Раствор аскорбиновой кислоты, 10 г/л (в 0,1 н растворе HCI).
Ход работы
В центрифужную пробирку с надписью Пщ внести 1 мл щелочного раствора, в пробирку с надписью Пк - 1 мл кислого раствора b-глицерофосфата и поместить их на 5 мин в термостат при 37 °С для прогревания субстратов. Затем осторожно, избегая образования пузырьков воздуха, в пробирки внести по 0,1 мл сыворотки крови и полученную фермент-субстратную смесь инкубировать в течение 1 ч при 37 °С. Время термостатирования опытных проб использовать для определения содержания неорганического фосфата в контрольных пробах. Для этого в центрифужные пробирки с надписью Кщ и Кк внести соответственно по 1 мл щелочного или кислого раствора b-глицерофосфата, прилить по 1,1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, после чего добавить по 0,1 мл той же сыворотки крови, пробы перемешать и через 5 мин центрифугировать в течение 10 мин при 3000 об/мин. Затем отобрать по 1,5 мл центрифугата и перенести в обычные пробирки с соответствующей маркировкой (Кщ и Кк), прибавить по 1 мл молибденового раствора, 1 мл раствора аскорбиновой кислоты, перемешать. Пробы выдерживают 10 мин при комнатной температуре, после чего их колориметрируют при красном светофильтре в кюветах шириной 5 мм. В качестве пробы сравнения используют дистиллированную воду. К опытным пробам после инкубации в термостате добавить по 1,1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешать и далее обработать и колориметрировать, как контрольные пробы. Активность щелочной и кислой фосфатаз рассчитывают, используя калибровочный график. Для построения калибровочной кривой готовят следующие растворы.
Реактивы | Номера пробирок | |||||
Рабочий раствор Рн, мл | 0,6 | 1,2 | 2,4 | 3,6 | 4,8 | 6,0 |
ТХУ, мл | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 |
Вода, мл | 5,9 | 5,3 | 4,1 | 2,9 | 1,7 | 0,5 |
Перемешать | ||||||
Отобрать в другие пробирки | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 |
Молибденовый раствор, мл | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
Аскорбиновая кислота | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
Содержание Рн (мг) в пробах | 0,001 | 0,002 | 0,004 | 0,006 | 0,008 | 0,010 |
Через 10 мин после прибавления аскорбиновой кислоты пробы колориметрировать при красном светофильтре в кювете шириной 5 мм против дистиллированной воды. При построении калибровочной кривой на оси абсцисс откладывать содержание Рн в пробах, а на оси ординат – величины оптической плотности. В качестве единицы масштаба взять 10 мм на 0,001 мг фосфора.
По калибровочной кривой рассчитать число мг Рн в опытных и контрольных пробах.
Активность щелочной фосфатазы = (Пщ-Кщ)×1,47×105/31 ммоль/ч×л
Активность кислой фосфатазы = (Пк-Кк) × 1,47×105/31 ммоль/ч×л,
где (Пщ-Кщ) или (Пк-Кк) – количество Рн, которое освободилось при действии фосфатазы; 1,47×105 – коэффициент пересчета с 0,068 мл на 1 л сыворотки; 31 – масса 1 ммоля Рн (мг).
Дата публикования: 2014-11-18; Прочитано: 1202 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!