Определение ОКБ и ТКБ методом мембранной фильтрации

(основной метод)

Метод основан на фильтрации определенного объема воды (300мл) через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической среде с лактозой (Эндо) и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим признакам.

Мембранные фильтры подготовленные к анализу (кипячёные или стерилизованные другим способом), помещают стерильным пинцетом в воронку фильтровального аппарата. В воронку прибора наливают отмеренный объем воды и создают вакуум. После фильтрования фильтр снимают и, не переворачивая, кладут на поверхность питательной среды Эндо. На одну чашку можно поместить 3 фильтра. При исследовании питьевой воды фильтруют 3 объема по 100 мл. при анализе воды неизвестного качества целесообразно фильтровать другие объемы воды для получения изолированных колоний на фильтре (10,40, 100 и 150 мл).

Чашки с фильтрами инкубируют вверх дном в термостате при t 37^оС в течение 24 часов.

Если на фильтрах нет роста или выросли нетипичные плёнчатые, плесневые, расплывчатые колонии, выдают отрицательный результат. ОКБ и ТКБ в 100 мл исследованной воды отсутствуют.

При росте на фильтрах типичных изолированных лактозоположительных (темно-красных с отпечатками на обратной стороне фильтра) колоний, подсчитывают их число и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.

-проводят микроскопию мазков из 3-4 колоний, окрашенных по Граму (учитывают грамотрицательные);

-определяют наличие оксидазы (учитывают оксидазоотрицательные, т.к. оксидазоположительные грамотрицательные палочки не относятся к энтеробактериям, а могут быть, например, псевдомонадами);

-определяют ферментацию лактозы до кислоты и газа при температуре 37^оС, что важно для слабоокрашенных колоний и отношения их к ОКБ, и температуре 44± 0,5^оС, чтобы решить вопрос об их принадлежности к ТКБ.

Постановка оксидазного теста

На бумагу, смоченную 1% спиртовым раствором α-нафтола и 1% водным раствором диметилфенилендиамина, наносят платиновой петлей или стеклянной палочкой часть окрашенной колонии. реакцию считают положительной, если в течение 1 минуты, максимум 4-х появляется синее или фиолетовое окрашивание. Оксидазоположительные колонии не учитывают и дальнейшему исследованию не подвергают.

Можно переносить фильтр с колониями на бумагу смоченную реактивом. Можно использовать готовые бумажные системы (СИБы), смоченные дистиллированной водой.

На способность ферментировать лактозу испытывают части колоний грамотрицательных оксидазоотрицательных бактерий. При этом используется полужидкая среда с лактозой и индикатором рН. Посев производится уколом до дна в 2 пробирки. Одна инкубируется при температуре 37±1^оС 24-48 часов для подтверждения отношения к ОКБ, другая при температуре 44± 0,5^оС 24 часа, возможен учет через 4-6 часов, для подтверждения наличия ТКБ.

При наложении колоний на фильтре, производится их рассев, затем полученные изолированные колонии идентифицируются. Колонии учитывают как ОКБ – если они красные на Эндо, содержат грамотрицательные оксидазоотрицательные палочки, разлагающие лактозу при температуре 37 ^оС до кислоты и газа. Колонии учитывают как ТКБ, если они содержат грамотрицательные оксидазоотрицательные палочки, ферментирующие лактозу при температуре 44 ^оС до кислоты и газа (схема № 2).

СХЕМА № 2