Методы окраски спор микроорганизмов

Споры имеют высокий показатель преломления из-за низкого содержания воды. Поэтому они хорошо видны на фоне вегетативных клеток при микроскопическом исследовании. Существуют различные способы окраски спор микроорганизмов. Все они основаны на протравливании кислотами или щелочами споровой оболочки, которая разрыхляется и облегчает проникновение краски. Наиболее распространенными являются методы Ожешко, Пешкова и Циля.

Метод Ожешко. Препарат высушивают на воздухе и, не фиксируя, протравливают 0,5% соляной кислотой при осторожном нагревании. Для этого предметное стекло с одного конца берут пинцетом и подогревают до появления пара (не допускать кипения!) в течение 2-3 минут. Затем препарат охлаждают, осторожно промывают водой, подсушивают и фиксируют над пламенем горелки. На фиксированный препарат кладут листок фильтровальной бумаги размером 10x10 мм, наливают на него карболовый фуксин Циля (рец. 10) и осторожно подогревают до паров (не допускать кипения!) в течение 7-8 минут, В течение этого времени следят за наличием краски на препарате и по мере испарения осторожно по каплям добавляют ее, не допуская высыхания. После прогревания ли­сток фильтровальной бумаги снимают пинцетом, сливают остатки краски, препарат обрабатывают 5-7 секунд 5% раствором серной кислоты, тщательно промывают дистиллированной водой, докрашивают метиленовым синим Леффлера (рец. 11) или 1% раствором малахитовой зелени в течение 3-4 минут, вновь промывают дистиллированной водой и высушивают. Препарат микроскопируют под масляной иммерсией. При правильном окрашивании вегетативная часть клетки будет синяя (зеленая), а споры - красные.

Метод Пешкова. Мазок фиксируют над пламенем горелки. На фиксированный препарат кладут листок фильтровальной бумаги, наливают водно-спиртовой раствор метиленового синего (рец. 12), нагревают до кипения, смывают дистиллированной водой. Затем препарат докрашивают в течение 10-15 секунд водным раствором нейтрального красного, смывают дистиллированной водой, просушивают и микроскопируют под масляной иммер­сией. При правильном окрашивании вегетативная часть клетки окрашивается в красный цвет, а споры - в синий.

Метод Циля. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки, протравливают 5% раствором хромовой кислотой в течение 5-10 минут и промывают дистиллированной водой. Излишки воды сливают, на препарат кладут листок фильтровальной бумаги и наливают карболовый фуксин Циля. Предметное стекло берут пинцетом и подогревают до появления пара (не допускать кипения!). Затем препарат промывают дистиллированной водой, обес­цвечивают в течение 10-15 минут 1% раствором серной кислоты и быстро промывают дистиллированной водой. После этого препарат течение 15 – 20 минут докрашивают метиленовым синим, промывают дистиллированной водой и высушивают. Препарат микроскопируют под масляной иммерсией. При правильном окрашивании вегетативная часть клетки будет синяя, а споры - красные.

Для окраски спор на практических занятиях можно использовать культуры Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus antracoides.