Электронная микроскопия

Возможности светового микроскопа ограничены слишком большой длиной волны видимого света (в среднем около 0,55 мкм). Поэтому частицы, диаметр которых меньше этой величины, находится за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Для исследования таких мелких частиц используют электронный микроскоп, в котором вместо световых волн используется поток электронов. Источником электронов является раскаленная вольфрамовая нить, которая разогревается до 2500°С. Направленный электронный поток вызывает свечение флюоресцирующего экрана. Если на пути электронного потока находится объект, то на экране соответствующие места будут более или менее затемненными.

Роль линз в электронном микроскопе выполняет круговое магнитное поле. Магнитная линза фокусирует первый пучок электронов, прошедший через объект, в первое действительное изображение, увеличенное примерно в 200 раз. Магнитный промежуточный проектор (аналогичный линзе окуляра) увеличивает первое изображение примерно в 250 раз. Таким образом, общее увеличение объекта составляет 50000 раз. Окончательное увеличенное изображение можно увидеть на флюоресцирующем экране или на фотопластинке. Отдельные части фотографии можно увеличить еще в 6 раз. Это позволяет получить изображение объекта, в общем увеличенное в 300000 раз. Поскольку воздух препятствует движению электронов, внутри микроскопа необходимо поддерживать вакуум. Для откачивания воздуха существуют специальные приспособления.

Исследуемый объект предварительно фиксируют специальными смесями, многие из которых содержат четырехокись осмия. Затем объект исследования наносят на чрезвычайно тонкую коллодиевую или целлюлозную пленку, толщиной в 0,01 мкм, которую предварительно накладывают на специальные сеточки - подложки.

Для определения деталей структуры микроорганизма используют специальные методы - напыление, негативное контрастирование и сканирующую микроскопию.

Метод напыления или «затенения» широко используют в электронной микроскопии. Суть метода состоит в том, что на поверхность препарата под определенным углом напыляют тонким слоем в 7 нм различные тяжелые металлы: хром, золото, палладий. Напыление производят пучком ионов металла в вакууме. Частички металла в виде паров оседают на возвышающихся участках поверхности микроорганизма, а с противоположной стороны образуется своеобразная «тень», т.е. зона, не покрытая ионами металла. Этим достигаются трехмерное рельефное проявление деталей структуры исследуемого объекта и возможность определения различий между ними.

Метод негативного контрастирования. На препарат наносят растворы, содержащие атомы тяжелых металлов, например, фосфорно-вольфрамовую кислоту. Осаждаясь около белковых частиц и заполняя все имеющиеся пространства и трещины, атомы тяжелых металлов не пропускают электроны, и тем самым созда­ют фон с различной контрастностью, на котором выявляются мельчайшие детали строения микроорганизмов.

Сканирующая микроскопия. Препарат покрывают тонкой пленкой ионов тяжелых металлов и облучают направленным вниз пучком электронов. Отражаясь от этой пленки, электроны с помощью специальных устройств фокусируются, и на флюоресцирующем экране формируется окончательное изображение.