Изучение морфологических и биохимических свойств штаммов микроорганизмов

Анализ данных литературы показывает, что в настоящее время наиболее перспективными в качестве основы для разработки нового пробиотика могут быть штаммы бактерий рода Lactobacillus. Совокупность биологических свойств бактерий родов Lactobacillus и биологически активных веществ, продуцируемых ими, обеспечивает комплексное действие пробиотического препарата.

Для изучения и выбора активных штаммов лактобацилл исследовали культуры штаммов L. buchueri 2, L. plantarum FK20, L. ferrmentum 90T-C4, L. fermentum B-4916, L_. acidophilus 1 EC, L. acidophilus B-2104, полученных из трех районов Южно-Казахстанской области.

Культурально - морфологические и физиолого-биохимические свойства выше указанных культур представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Культурально-морфологические и физиолого-биохимиеские свойства бактерий рода Lactobacillus

Культура штамма	Культурально-морфологические свойства	Физиолого-биохимические свойства
L. buchneri 2	Грамположительные палочки размером 0.5-2,4 мкм. Oтмеченная высокая гетерогентность. На плотных питательных средах образует выпуклые колонии с цельным ровный красна на 2 сутки образуется пигмент желтого цвета.	Ферментирует без образования газа глюкозу, рамнозу, сахарозу, талактозу, лактозу. Восстанавливает лакмусовое молоко, образует аммиак аргинина.
L- planlarum FK20	Грамположительные палочки размером 1-10 мкм. На плотных питательных средах образуя выпуклые колонии с цельным ровным краем, белого цвета диаметром до 5 мм.	Ферментирует без образования газа глюкозу, рамнозу, сахарозу, галактозу, лактозу, слабо – сорбит, мальтозу, салицин, магнит. Восстанавливает лакмусовое молоко, образует аммиак аргинина.
L. fermentum В-4916	Грамположительные мелкие палочки, расположенные одиночно или в цепочках. На плотных питательных средах образует мелкие ровные, выпуклые, непрозрачные колонии.	Ферментирует глюкозу, рамнозу сахарозу, раффинозу, не сбраживает салицин. Развивается в присутствии поваренной соли (4%), восстанавливает лакмусовое молоко, образует аммиак из аргинина
L. fermentum 90Т-С4	Грамположительные мелкие палочки, расположенные в цепочки. На плотных питательных средах образует мелкие выпуклые колонии с ровным краем белого цвета	Расщепляет глюкозу с образованием кислоты и газа, Разлагает лактозу, мальтозу, галактозу, слабо - маннозу и сахарозу. Сорбит, целлобиозу, раффинозу, салицин, маннит не сбраживает. Частично восстанавливает лакмусовое молоко, образует аммиак аргинина.

Учитывая, что в состав экспериментального образца пробиотика были вкючены культуры штамма L. рlantarum FK20, приведем их исходные паспортные характеристики.

Высокой устойчивостью и ингибирующим фактором роста обладает штамм L. planlarum FK20.

Чем больше углеводов расщепляет микроорганизм, тем больше количество продуктов брожения всасывается из толстого кишечника в кровь и используется микроорганизмом. Отсутствие при этом образования газа предотвращает вспучивание.

Резюмируя результаты изучения биохимических свойств микроорганизмов, мы пришли к заключению, что L.buchneri 2 не может использоваться для изготовления пробиотика, поскольку обладает недостаточно высокой активностью кислотообразования, не развиваются в кислой среде и неустойчивы к фенолу.

L. fermentum 90Т-С4 не соответствует предъявленным требованиям, поскольку является низким кислотообразователем, неустойчив к желчи и не отличается широким спектром сахаролитических свойств.

Он обладает высокой активностью кислотообразования, устойчив к желчи и фенолу, сбраживают широкий спектр углеводов без образования газа, что необходимо для размножения в условиях желудочно – кишечного тракта.

Однако в борьбе с другими микроорганизмами (в том числе и с патогенными) за экологическую нишу недостаточно только этих качеств. Микроорганизмы пробиотического препарата могут успешно конкурировать за среду обитания, находясь не в содержимом просвете кишечника, а непосредственно фиксируясь на поверхности чувствительных к ним клеток микроорганизма.

Исходя из этого предположения, мы изучали способность микроорганизмов адгезироваться на клетках желудочно – кишечного тракта, то есть, способность распознавать чувствительные к ним клетки микроорганизма и прикрепляться к ним.

Критериями для отбора микроорганизмов, пригодных для изготовления пробиотиков, послужила активность кислотообразования и предельная кислотность сгустков, поскольку эти показатели свидетельствуют об интенсивности кислотообразования и количестве образуемой кислоты, губительно действующей на гнилостную микрофлору.

Изучаемые штаммы должны обладать высокой активностью кислотообразования. Оценку уровня кислообразования лактобактерий проводили титрометрическим методом при выращивании лактобацилл в мясо – пептоном бульоне. Результаты исследований по изучению уровня кислотообразования представлены в таблице 3.

L. fermentum B-4916 образует сгусток в молоке через 4-5 часов, однако предельная кислотность сгустка очень низкая и составляет 70°Т. Низкая кислотообразующая способность ацидофильной палочки – ценное свойство для

Таблица 3 - Оценка уровня кислотообразования лактобактерий

Культура штамма	Предельная активность кислотообразования, °Т
L.buchneri 2	85-95
L. plantarum FK20	220- 225
L. fermentum B-4916	70-75
L. fermentum 90T-C4	90-111
L. acidophilus IK	70 -80

изготовления молочных продуктов, поскольку сейчас в коллекциях представлены в основном ацидофильные палочки – сильные кислотообразователи, однако для изготовления биопрепарата – это негативный фактор.

Достаточно активным кислотообразователем является L. acidophilus B-2104, образующий сгусток в молоке через 8-12 часов.

L. plantarum FK20 свертывает молоко через 20-24 ч и 50-56 ч соответственно, кислотность сгустков не превышает 225°Т.

К микроорганизмам со средней активностью кислотообразования можно отнести L. fermentum 90T-C4, L. acidophilus B-2104, L.buchneri 2 образующие сгустки в течение 16-18 ч.

По результатам изучения морфологических и биохимических свойств высокой устойчивостью и ингибирующим фактором роста обладает штамм L. planlarum FK20. Также L. plantarum FK20 свертывает молоко через 20-24 ч и 50-56 ч соответственно, кислотность сгустков не превышает 225°Т. Анализируя полученные данные, мы определили, что наиболее полно предъявленным требованиям отвечает L. planlarum FK20.

Учитывая, что в состав экспериментального образца пробиотика были вкючены культуры штамма L. рlantarum 8Р – А3, приведем их исходные паспортные характеристики.

Бактерии штамма L. рlantarum FK20 микроскопически представляют собой грамположительные палочки, расположенные одиночно или в цепочках, размером от 1,0 до 8,4 мкм. На плотных питательных средах (MRS, капустном агаре) на 2 сутки культура образует мелкие ровные колонии белого цвета диаметром от 2 до 5 мм, выпуклые, с цельным краем, непрозрачные, без пигмента [41].

Оптимальные значения рН питательной среды составляют от 5,8 до 6,2. Культура устойчива при понижении кислотности среды. Оптимальная темтература роста – 37 ºС.

Культура штамма L. рlantarum FK20 развивается в мясопептонном бульоне с 6 % содержанием хлорида натрия, ферментирует без образования газа глюкозу, рамнозу, сахарозу, галактозу, сорбит, мальтозу, лактозу и салицин. Восстанавливает лакмусовое молоко.

Штамм молочнокислых микроорганизмов, которые непосредственно использовали в исследованиях, поддерживали и сохраняли методом пересева в стерильное обезжиренное молоко каждые 10 дней. Между пересевами культуры хранили в холодильнике при +4 - +18 °С. Однако этот метод трудоемок и требует большого количества обезжиренного молока.

Более удобным методом хранения молочнокислых микроорганизмов является их хранение в пробирках с гидролизованным молоком (рН 7,2) при температуре 2-4 °С. В таких условиях все исследуемые культуры хранились в течение двух месяцев, практически не изменяя свои свойства [42].

Молочнокислые микроорганизмы длительное время до шести месяцев сократились следующим образом: культуру засевали уколом в полужидкий агар на гидролизованном молоке (0,75 агар). После термостатирования заливали тонким слоем стерильного вазелиного масла. Масло должно быть высокой вязкости и не содержать продуктов окисления и токсических веществ, слой масла должен на 1 см превышать края агара. Культура хранилась в холодильнике.

Опыты проводили с целью отбора по сумме признаков тех штаммов, которые могли бы размножаться в условиях желудочно – кишечного тракта и использоваться для изготовления пробиотика.

Важным критерием при отборе микроорганизмов для изготовления пробиотика является их устойчивость к различным ингибирующим веществам – натрия хлориду, желчи, действию которой они подвергаются в тонком отделе кишечника, фенолу, образующемуся в толстом отделе кишечника при гнилостном распаде белков. Биохимические свойства лактобактерий представлены в таблице 4. Как видно из таблицы 4, свойства исследуемых штаммов соответствуют биохимическим свойствам. Данные свидетельствуют о том, что в присутствии 0,4; фенола в среде не размножаются штаммы L. buchneri 2 и L. fermentum В-4916. К желчи неустойчивы – L. buchneri 2.

Для изучения и выбора активных штаммов бацилл исследовали культуры штаммов B.subtilis ТПИ-9, B.subtilis ТПИ-13, B.subtilis F7, B.licheniformis 31 полученных из музея кафедры «Биотехнология».

Культурально - морфологические и физиолого-биохимические свойства выше указанных культур представлены в таблице 5.

Таблица 4 - Биохимические свойства микроорганизмов рода Lactobacillus

№	Свойства микроорганизмов	Название штаммов
L. buchneri 2	L. planlarum FK20	L. fermentum В-4916	L. fermentum 90Т-С4
	Рост в гидролизованном молоке с хлоридом натрия, 2% 4% 6,5%	+ - -	+ + -	- - -	- - -
	Рост в гидролизованном молоке с желчью, 20% 30% 40%	+ - -	+ + +	- + +	+ - -
	Рост в обезжиренном молоке с 0,4% фенола	-	+	-	-
	Рост в обезжиренном молоке с 0,05% метиленового голубого	+	-	-	-
	Образование: NH3 СО2	+ -	+ +	+ -	- -
	Образование: глюкоза лактоза арабиноза ксилоза галактоза манноза рамноза мальтоза	+ + + + - - - +	+ + - + + - + +	+ + - - - + - -	- - - - + - - +

Таблица 5 - Культурально-морфологические и физиолого-биохимиеские свойства бактерий рода Bacillus