Методические указания. 1. Методы оценки фагоцитирующих клеток крови

1. Методы оценки фагоцитирующих клеток крови. Образец крови или лейковзвеси инкубируют с бактериями или другими объектами фагоцитоза (частицы латекса, полистиреновые час­тицы) в течение 1—2 ч, после чего из этой смеси приготавли­вают мазок, окрашивают по методу Романовского—Гимзы и микроскопируют, подсчитывая 100 клеток для определения процента фагоцитирующих клеток и количества бактерий (час­тиц), захваченных этими клетками (рис. 10.3.1; на вклейке). В норме процент фагоцитирующих лейкоцитов колеблется от 40 до 80 %, а количество захваченных частиц на 1 клетку — от 1 до 5. В качестве косвенного показателя бактерицидности фагоци­тирующих клеток оценивают интенсивность окислительного взрыва в фагоцитах по способности восстанавливать желтый краситель нитросиний тетразолий (НСТ) с формированием в цитоплазме клеток осадка темно-синего формазана. Чем ак­тивнее окислительный взрыв в фагоцитах, тем большая доля клеток содержит осадок формазана. После подсчета клеток доля формазан-положительных выражается в процентах. При инкубации лейкоцитов здоровых лиц только с красителем без индуктора окислительного взрыва доля формазан-положитель­ных клеток не превышает 1—2 %. При инкубации лейкоцитов здоровых лиц в присутствии индуктора окислительного взрыва (объекты фагоцитоза, бактериальный липополисахарид или полисахарид) все 100 % фагоцитов могут ответить окислительным взрывом и накоплением осадка формазана. Снижение доли формазан-положительных клеток свидетельствует о де­фектности кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов.

2. Методы определения количества лимфоцитов в крови. Изу­чение лимфоцитов начинается с их выделения из крови. Мо-нонуклеарные лейкоциты (лимфоциты, моноциты) отделяют от других клеток крови (гранулоцитов и эритроцитов) с помощью центрифугирования в градиенте плотности специальной смеси препаратов: фикол, верографин. Взятая из вены кровь смеши­вается с антикоагулянтом, вносится в пробирку с названной смесью и центрифугируется. Имеющие большую плотность эритроциты и гранулоциты образуют осадок на дне пробирки, а мононуклеарные клетки образуют кольцо на поверхности градиентной смеси, откуда могут быть перенесены в отдельную пробирку и отмыты от градиентной смеси.

Все зрелые лимфоциты имеют одинаковую морфологию: малых лимфоцитов с плотным ядром и узким ободком цито­плазмы. Дифференцировка популяций и субпопуляций лимфо­цитов связана с выявлением поверхностных маркеров — осо­бых для каждого типа клеток антигенов с помощью соответст­вующих специфических антител.

Естественные киллеры несут поверхностный маркер CD16. Все Т-лимфоциты (тотально) несут поверхностный маркер CD3. Т-лимфоциты делятся на субпопуляции: Т-хелперы несут маркер CD4, а цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) несут маркер CD8. Все В-лимфоциты несут поверхностный маркер CD19. В-лимфоциты несут на поверхностной мембране поверх­ностные иммуноглобулины, которые могут быть выявлены в качестве антигенов с помощью флюоресцирующих антиимму-ноглобулиновых антител (в том числе — против отдельных изо-типов иммуноглобулинов). Эти поверхностные иммуноглобу­лины также рассматриваются как поверхностные маркеры В-лимфоцитов.

Определение количества лимфоцитов разных популяций и субпопуляций по поверхностным маркерам проводится с по­мощью двух разных вариантов методов:

люминесцентной или световой микроскопии мазков цельной крови или взвеси мононуклеаров, обработанных соответствующими моноклональными антителами, ме­ченными флюорохромом или ферментом;

автоматического подсчета клеток с использованием про­точного цитофлюориметра (рис. 10.3.2).

При использовании первого методического варианта важно получить видимый осадок комплексов антител с красителем на поверхности клетки. Этот метод очень трудоемкий и длительный. Подсчет количества основных субпопуляций лимфоцитов данным методом занимает неделю.

Клетки ниже порога флюоресценции

Клетки выше порога флюоресценции

Рис. 10.3.2. Подсчет лимфоцитов разных популяций и субпопуляций с помощью проточного цитофлюориметра.

В отличие от этого с помощью автоматизированного под­счета с использованием современного прибора — проточного цитофлюориметра — это удается сделать за один день. Образец цельной крови инкубируют с моноклональными антителами, меченными флюоресцентным красителем, пропускают через тонкую трубочку, на выходе из которой формируется струя из капель. Многие из них содержат только по одной клетке. Каждая капля проходит перед лазерным лучом. Если капля содержит клетку, клетка вызывает отклонение лазерного луча, а лазерный луч возбуждает свечение флюорохрома в молекуле антитела, связанного с антигеном на поверхности клетки (с поверхностным маркером). Чувствительный фотоумножитель

Популяции Поверх- % от всего Абсолютное количе-и субпопуляции костные количества ство клеток х 109 лимфоцитов маркеры лимфоцитов в 1 л крови Лимфоциты (всего) 100 1,50—3,50 В-лимфоциты CD19 15 (10-25) 0,30-0,90 Т-лимфоциты (всего) CD3 75 (60-90) 1,00—2,50 Т-лимфоциты/хелперы CD4 50 (32—65) 0,50—1,60 Т-лимфоциты/киллеры CD8 25 (16-39) 0,30—0,90 Естественные киллеры CD16 10 (5-15) 0,20—0,30