Методические указания. 1. Иммунофлюоресцентный анализ

1. Иммунофлюоресцентный анализ. Один из наиболее чувст­вительных методов выявления связывания антител с антигена­ми в клетках и тканях — Иммунофлюоресцентный анализ. Спе­циальный флюоресцентный краситель (флюорохром) прикреп­ляется химической связью к молекуле специфического анти­тела, не нарушая его специфичности. Часто используют кра­ситель изотиоцианат флюоресцеина, обладающий желто-зеле­ной флюоресценцией. Красители, выбранные для иммунофлюоресцентного метода, активируются светом одной длины вол­ны (чаще — ультрафиолетовой части спектра), а сами испуска­ют лучи другой длины волны (видимого спектра). В люмине­сцентном микроскопе используется в качестве источника све­та, возбуждающего люминесценцию, ртутная лампа с системой селективных фильтров, пропускающих в окуляр только свет флюоресцирующего красителя. Прикрепляя разные красители к разным антителам, можно одновременно выявлять несколько антигенов в одной клетке.

Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного мик­роорганизма в исследуемом материале, в связи с чем его на­зывают методом экспресс-диагностики.

Недостатком прямого иммунофлюоресцентного метода яв­ляется необходимость приготовления широкого набора флюо­ресцирующих специфических антител против каждого из изу­чаемых антигенов. Поэтому чаще используют непрямой имму-нофлюоресцентный метод, при котором связанные с антиге­ном специфические антитела (немеченые) выявляются с помо­щью флюоресцирующих антииммуноглобулиновых антител против иммуноглобулинов того вида, которому принадлежат антиген-специфические антитела.

Применяют и иммуногистохимический метод, при котором к специфическим антителам прикрепляется фермент (напри­мер, пероксидаза хрена), способный превратить бесцветный субстрат в окрашенные продукты его ферментативного разло­жения, видимые в обычный световой микроскоп.

Для использования при электронной микроскопии антиген-специфические антитела можно метить частицами золота, ло­кализация которых укажет на расположение соответствующего антигена.

При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса спе­цифические флюоресцирующие антитела образуют комплексы с микробными антигенами, которые светятся при люмине­сцентной микроскопии препаратов (рис. 10.1.2).

Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки — антиглобули-новой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов, поскольку диагностические антисыворотки получают путем иммунизации кроликов. При этом на образующемся комплексе (специфические антитела + исследуемый антиген) фиксируют­ся флюоресцирующие антиглобулиновые антитела, обеспечи­вая его свечение при люминесцентной микроскопии (см. рис. 10.1.2).

На предметном стекле готовят мазок из исследуемого мате­риала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кро­личьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген—антитело

Повышение специфичности и чувствительности иммуно-ферментного анализа, так же как и иммунофлюоресцентного и радиоиммунного методов, связано с использованием моно-клональных антител (МКАТ).

Для получения МКАТ мышей иммунизируют очищенным препаратом антигена, затем выделяют лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов и проводят слияние их с миеломными клетками-партнерами. Неслившиеся миеломные клетки поги­бают, так как они дефектны по синтезу некоторых нуклеотидов и не могут выжить на селективной среде без этих нуклеотидов. Неслившиеся лимфоциты погибают в культуре из-за отсутст­вия в среде необходимых им трофических факторов. Выживают только гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от ми-еломных клеток способность к пролиферации в культуре, а от лимфоцитов — способность к синтезу антител соответствую­щей специфичности. Надосадочную жидкость культур гибри­дом исследуют с помощью ИФА с соответствующим антиге­ном. После выявления клеток, секретирующих нужные анти­тела, их клонируют методом лимитирующих разведений, т.е. клетки разводят таким образом, чтобы получить дочернюю культуру из одной клетки. Тогда все потомство будет генети­чески идентично: одна клетка дает один клон, который проду­цирует МКАТ.

3. Радиоиммунный анализ. Радиоиммунный анализ (РИА) является чрезвычайно чувствительным методом, который мо­жет быть использован для количественного определения лю­бого антигена. Чувствительность метода позволяет выявлять незначительные количества антигена.

Для проведения жидкостного радиоиммунного анализа очи­щенный известный антиген метят радионуклидами, чаще всего ¹²⁵1. В этом случае используют конкурентный вариант связы­вания, когда для определения количества антигена в исследу­емом образце оценивают его способность конкурировать с меченым референс-антигеном в связывании со специфическими антителами. Образующиеся комплексы антиген—антитело выде­ляют осаждением (сульфатом аммония или антиантителами) и определяют их радиоактивность в сопоставлении с радиоактив­ностью несвязанного антигена в надосадочной жидкости. Ис­пользование ряда концентраций немеченого антигена позволяет построить стандартную калибровочную кривую, с помощью которой определяется концентрация исследуемого антигена.

Более современный метод — твердофазный РИА, при кото­ром специфические антитела фиксируются на твердой фазе, к ним добавляется исследуемый антиген, а затем меченый стан­дартный антиген. Определение связанной и несвязанной метки позволяет построить калибровочную кривую и определить ко­личество исследуемого антигена.

РИА широко применяют для количественного определения различных веществ: гормонов (инсулина, гормона роста, адре-нокортикотропного гормона, трииодтиронина, тироксина, эст­рогена), белков сыворотки крови (IgE, сс-фетопротеина и др.), метаболитов (фолиевой кислоты, циклических нуклеотидов и др.), лекарственных препаратов (дигоксина, дигитоксина, мор­фина), микробных антигенов (HBsAg).

4. Реакция агглютинации. В лабораторной диагностике ин­фекционных заболеваний реакцию агглютинации очень часто применяют для идентификации видов и сероваров (серотипирование) бактерий с помощью диагностических агглютиниру­ющих сывороток. Реакция агглютинации (РА) на стекле (плас­тинчатая реакция агглютинации) ставится с одним разведением диагностической агглютинирующей сыворотки, которое в за­висимости от ее титра составляет 1:10, 1:25, 1:50 или 1:100.

Предметное стекло делят на квадраты восковым каранда­шом. В один квадрат наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия, в другой — каплю сыворотки. Затем петлей в каждую каплю вносят небольшое количество бактериальной культуры и перемешивают круговыми движениями в каждой капле до получения равномерной взвеси. Стекло можно слегка подогреть, высоко держа над пламенем горелки в течение 2—4 мин. Реакция протекает быстро. Наблюдают за появлени­ем зерен и хлопьев агглютината в каплях. Учет производят через 3—5 мин (рис. 10.1.3).

Кроме специфической агглютинации бактерий, вызван­ной антителами, возможна спонтанная агглютинация (в отсутствие иммунной сыворотки). Спонтанную агглютинацию
дают R-формы бактерий, не образующие гомогенной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждающиеся в виде клеточных агрегатов. При кислой реакции среды в резуль­тате снятия одноименного заряда с поверхности бактериальных клеток в изоэлектрической зоне также происходит склеива­ние — наступает "кислотная" агглютинация. Чтобы ис­ключить возможность учета ложноположительных результатов спонтанной агглютинации, всегда ставят контрольную пробу с < изотоническим раствором хлорида натрия.

5. Реакция непрямой гемагглютинации. Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агг­лютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токсинов — в исследуемом пато­логическом материале. Соответственно используют стандарт­ные (коммерческие) эритроцитарные антительные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфических антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритро­цитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последователь­ные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку

Ингредиенты, мл Опыт- Номер контрольной пробирки ная 1 1 р проба 1234 Стандартная преципитирующая 0,3 — 0,3 0,3 0,3 сыворотка Нормальная кроличья сыворотка — 0,3 — — — Экстракт исследуемого материала 0,3 0,3 — — — Стандартный антиген _____ Контрольный экстракт — — 0,3 — — Изотонический раствор хлорида — — — — 0,3 натрия Результаты

Манипуляции Номера пробирок опытные контрольные 1234 5 1к 2к Зк Приготовление разведе- 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:10 — — ний типоспецифической сыворотки Внесение сыворотки, мл 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 — — Внесение суспензии ви- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 — 0,2 — руса (4 гемагглютини-рующие дозы в 0,2 мл) Внесение изотоническо- — — — — — — 0,2 0,4 го раствора хлорида на­трия, мл Экспозиция 60 мин при комнатной температуре Внесение 1 % суспензии 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 эритроцитов курицы, мл Экспозиция 30—60 мин при комнатной температуре Учет результатов

Типоспецифи- Разведение сыворотки Контроль ческая проти 1 1 1 1 1 вогриппозная 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 сыво- виру- эрит- сыворотка ротки са роци- тов HON1 — + -Н-+ +++ +++ — +++ — H1N1 — ++ +++ +++ +++ — +++ — H3N2 ______ +++ _

Тема 10.2. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ (СЕРОДИАГНОСТИКА)

Количество специфических антител в сыворотке крови можно определить методами непосредственного выявления связывания со специфическим антигеном. Два наиболее совре­менных метода серологических исследований: радиоиммунный и иммуноферментный. В любом случае нужен известный очи­щенный антиген, к которому прикрепляется метка: радионук-лидная или ферментная. Соответственно связывание меченого антигена с антителами учитывается радиометрическим или спек-трофотометрическим методом.

Кроме методов непосредственного выявления связывания антител с антигеном, используют серологические исследова­ния, основанные на изменении свойств антигена: реакции агглютинации, преципитации, иммунного лизиса, связывания комплемента, нейтрализации.

План

Программа

Методы непосредственного выявления связывания ан­тигена с антителами: радиоиммунный метод, иммуно­ферментный метод, иммунофлюоресцентный метод.

Методы связывания антигена с антителами, проявля­ющегося изменением свойств антигена: реакция агг­лютинации, реакция преципитации, реакции иммун­ного лизиса, реакция связывания комплемента, реак­ции нейтрализации.

Демонстрация

1. Диагностические препараты для выявления антител (диагностикумы).