Дополнительный материал. Микробиологическая диагностика возбудителя туберкулеза.Возбудителями туберкулеза у людей и животных являются Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis

Микробиологическая диагностика возбудителя туберкулеза. Возбудителями туберкулеза у людей и животных являются Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis. Лабораторная диагностика туберкулеза включает обязательные методы (рекомендованные ВОЗ) — бактериоскопический и бак­териологический и дополнительные — биологический, серологи­ческий и аллергический. Материалом для исследования, исходя из патогенеза и клини­ческих проявлений, служат: мокрота, слизь с задней стенки глот­ки, гной, спинномозговая жидкость, кал, промывные воды же­лудка и бронхов, плевральный экссудат и др. Его собирают в сте­рильную посуду (мокроту — в специальные баночки, спинномоз­говую жидкость и другие материалы — в пробирки), которую эти­кетируют и направляют в специализированные лаборатории вме­сте с бланком, где указывают Ф.И.О. больного, группу диспан­серного учета, диагноз, цель исследования.

Микроскопия. Это исследование входит в обязательный поли­клинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. Положительный результат может быть по­лучен при концентрации микобактерий туберкулеза в материале не менее 10³ клеток/мл. Мокроту выливают в чашку Петри, ставят на черную поверх­ность стола, выбирают комочки гноя, наносят их на предметное стекло и растирают между двумя стеклами. Мазки высушивают в пламени и окрашивают по Цилю—Ниль­сену. Микобактерии туберкулеза, окрашенные в ярко-красный (ру­биновый) цвет, имеют вид тонких, длинных, слегка изогнутых или коротких прямых палочек; иногда в них обнаруживается зер­нистость. Микобактерии располагаются поодиночке или непра­вильными группами. Если микобактерий в материале мало и их не удается обнаружить в мазках обычным путем, применяют методы обогащения — гомогенизации и фло­тации.

Метод гомогенизации. Суточное количество мокроты выливают во флакон или банку, добавляют равный объем 1%-го водного раствора гидроксида натрия, плотно закрывают резиновой проб­кой и энергично встряхивают до полной гомогенизации (10 — 15 мин). Мокроту, утратившую вязкость, центрифугируют, надо­садочную жидкость сливают в дезинфицирующий раствор, оса­док нейтрализуют добавлением 2 — 3 капель 10%-й соляной или 30%-й уксусной кислоты. Из осадка готовят мазки и окрашивают по Цилю –Нильсену.

Метод флотации. Суточное (иногда 2-суточное) количество мок­роты гомогенизируют описанным выше способом. Для того, чтобы в материале не осталось слизистых комочков, флакон с гомогени­зированной мокротой помещают на 30 мин в водяную баню при +55 °С. Затем добавляют 1-2 мл ксилола (можно вместо ксилола добавить бензол, бензин, петролейный эфир и т.п.) и встряхива­ют в течение 10 мин, доводят дистиллированной водой уровень жидкости до горлышка флакона и дают ей 20-30 мин отстояться при комнатной температуре. Капельки ксилола с адсорбирован­ными микобактериями всплывают, образуя сливкообразный слой — флотационное кольцо. Материал из флотационного коль­ца берут петлей в форме улитки или пипеткой и наносят на пред­метное стекло, помещенное на подогретое до +55°С над водяной баней стекло. Высохший мазок покрывают новой порцией мате­риала до тех пор, пока на предметное стекло не будет перенесе­на большая часть флотационного слоя. Препарат промывают эфи­ром, высушивают, фиксируют и окрашивают по Цилю – Ниль­сену.

Для микроскопической диагностики туберкулеза широко при­меняют люминесцентную микроскопию. Фиксированный препа­рат окрашивают 15 мин. аурамин-родамином (при подогревании), затем обесцвечивают 3%-м солянокислым спиртом (погружением на 30 с), при необходимости для погашения фона докрашивают перманганатом калия (КМп0₄) или метиленовым синим, тща­тельно промывают и микроскопируют в ультрафиолете при уве­личении от 250х до 650х. Наблюдают ярко-желтое свечение мико­бактерий на темном фоне. При микроскопическом исследовании следует уделить особое внимание осмотру всей площади мазка. Чтобы с уверенностью судить о наличии или отсутствии микобактерий в препарате, сле­дует просмотреть не менее 100 полей зрения. Бактериоскопический метод позволяет лишь обнаружить кис­лотоустойчивые микобактерии, поэтому является ориентировоч­ным методом диагностики. Для точной дифференциации мико­бактерий необходимо применить бак­териологический метод.

Бактериологическое исследование. Выделение возбудителя яв­ляется более эффективным, чем бактериоскопия, и позволяет вы­явить 20 — 100 и более микобактерий в 1 мл исследуемого матери­ала, а также определить их устойчивость к лекарственным препа­ратам, вирулентность, типовую принадлежность и другие важные характеристики. Недостатком метода является длительность иссле­дования — 2—12 нед. В качестве плотных сред для выделения используют яичную среду Левенштейна-Йенсена, среду Финна II и другие. Колонии микобактерий туберку­леза непигментированные морщинистые, суховатые, с неровны­ми краями, возвышаются над поверхностью среды и напоминают бородавки. При отсутствии роста в течение 12 нед. Результат счи­тается отрицательным. Выросшие культуры микобактерий микроскопируют (после окраски мазков по Цилю-Нильсену) и проводят их идентифи­кацию по дифференцирующим признакам.

Ускоренный метод бактериологической диагностики туберкулеза (метод микрокультур Прайса). Мокроту, гной, осадок мочи или другой материал наносят толстым слоем на несколько стериль­ных узких (1 см) предметных стекол. Высушенный препарат берут стерильным пинцетом и погружают на 15 мин в 2%-ю серную кислоту, а затем — в стерильный раствор ИХН для промывания с целью удаления кислоты. После этого препараты помещают во флаконы с цитратной кровью, стараясь полностью погрузить ма­зок с материалом в среду. Технически данные методы выделения чистых культур трудо­емки и небезопасны. В настоящее время применяют полностью автоматизированные системы ВАСТЕС, в которых используются элективные среды и реагенты для флюоресцентного окрашива­ния микобактерий, что позволяет провести идентификацию мик­робов, а также определить чувствительность к антибиотикам в течение 3—15 дней (в среднем 4 — 6 дней). Методика полностью безопасна и позволяет одновременно производить культивирова­ние от 240 до 960 образцов.

Тема лабораторной работы: Возбудители дизентерии, кишечных эшерихиозов, холеры.

ЦЕЛИ: знать возбудителей холеры, кишечных эшерихиозов, дизентерии, их морфологические и физиологические особенности, факторы вирулентности, источники и механизмы заражения человека; методы микробиологической диагностики возбудителей дизентерии, кишечных эшерихиозов, холеры, средства и методы лечения и профилактики указанных инфекций; уметь обосновать выбор методов исследования, материала, особенностей его забора и доставки в лабораторию, интерпретировать результаты исследований.