Схема титрования бактериофага на жидкой

Ингредиен- ты	Разведение фага	КК	КФ
10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7	10-8
Питатель- ный бульон, мл   Титруемый фаг, мл	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5 } 0,5	4,5   -	4,5   0,5
Суточная культура бактерий, в каплях										-

Термостат +37⁰С, 18-20 часов.

Примечание: КК - контроль культуры,

КФ - контроль фага.

1) Готовят последовательные десятикратные разведения испытуемого фага в жидкой питательной среде: 10^-1, 10^-2, 10^-3, и т.д. Для этого в ряд пробирок вносят 4,5 мл питательного бульона. Затем в первую пробирку вносят 0,5 мл титруемого фага, получают первое разведение фага 10^-1; содержимое 1-й пробирки перемешивают и 0,5 мл из первой пробирки переносят во вторую пробирку, получают разведение 10^-2 и т.д. до разведения 10^-8 . Из последнего разведения 0,5 мл выливают в дез. раствор. После приготовления разведений к каждому разведению добавляют чувствительную культуру бактерий. Пробирки инкубируют в термостате при +37⁰С 18-20 часов. После инкубации отмечают наибольшее разведение фага, ещё вызывающее лизис чувствительной культуры (рост бактерий в этой пробирке отсутствует). Это разведение, и является титром фага. Например: «Титр фага – 10^-6».

2) Титрование фага на плотной питательной среде. Чашку с плотной средой делят на несколько зон. Культуру чувствительных бактерий высевают сплошным газоном на поверхность среды. Затем в соответствующие зоны наносят по капле различных десятикратных разведений фага. После инкубации в термостате при +37⁰С 18-20 часов отмечают наибольшее разведение фага, ещё вызывающее лизис чувствительной культуры (образование «стерильного пятна»).

Практическое применение фагов в медицине. Вирулентные фаги применяют для:

а) лечения и экстренной профилактики (при угрозе заражения) инфекционных заболеваний. Например: брюшнотифозный, дизентерийный, холерный Эль-Тор, коли – протейный, стафилококковый, гангренозные, синегнойный и др. фаги.

Б) диагностики с целью установления вида неизвестного микроба используются видовые фаги. Ставится опыт «ани» на плотной питательной среде. Например: неизвестную чистую культуру высевают сплошным газоном на чашку с плотной средой, на которую наносят каплю известного видового фага и инкубируют в термостате. Если культура бактерий соответствует данному фагу, в месте нанесения фага образуется «стерильное пятно» (зона лизиса культуры фагом).

В) фаготипирования с целью установления источника заражения применяются типовые фаги, например при изучении внутрибольничных вспышек инфекционных заболеваний, вызванных стафилококками. Если штаммы, выделенные от больного и предполагаемого источника инфицирования лизируются одними и теми же типовыми фагами, это означает, что обе культуры принадлежат к одному фаговару, следовательно, имеют общее происхождение.

Применение умеренных фагов:

а) на лизогенных бактериях изучают механизмы функционирования различных генов; с помощью трансдукции устанавливают локализацию генов на бактериальной хромосоме.

Б) лизогенные бактерии используются при поисках противоопухолевых веществ: если препарат обладает индуцирующими свойствами, т.е. вызывает переход профага в продуктивную форму (активную, инфекционную), следовательно, точкой приложения или действия этого препарата является нуклеиновая кислота, и препарат можно испытывать как противоопухолевый препарат.

В) лизогенные штаммы используют при изучении различных мутагенных факторов, например, в космических исследованиях – как индикаторы надежности защиты космических кораблей от жестких космических лучей: если по возвращению из космоса произошла индукция, и культура лизирована, следовательно, в корабль проникли космические лучи, т.е. защита корабля ненадежна.

Г) умеренные фаги широко используются в генной инженерии. Модель «профаг – клетка» лежит в основе вирусогенетической гипотезы происхождения опухолей

Концентрации антибиотиков в крови (К, мкг/мл) после введение средне-терапевтических доз препарата.