Качественна характеристика компонентов питательной среды

При использовании тех или иных сред для культивирования организмов с целью выяснения их антибиотических свойств важное значение имеет качественная характеристика отдельных компонентов среды. Под качественной характеристикой входящих в среду компонентов имеют в виду форму основных соединений, в которой они используются.

Источники углерода также могут быть различными: органические кислоты, спирты, сахара и полисахариды, сочетания различных углеродсодержащих соединений и т. д.

Присутствие в среде той или другой формы источника азота или источника углерода или другого компонента провоцирует организм, естественно, по-разному на них реагировать в зависимости от наличия у микроба тех или иных ферментативных систем и их активности и как результат определенно направлять реакции обмена веществ. Это может способствовать выявлению потенциальных антибиотических свойств микроорганизмов или, наоборот, тормозить их образование.

Подбирая среды нужного состава, следует учитывать специфику культивируемого организма. Это необходимо для создания оптимальных условий (с учетом специфики организма), которые бы способствовали наилучшему росту микроба и биосинтезу необходимых продуктов жизнедеятельности. Например, если организм не может синтезировать некоторые существенные для его жизнедеятельности соединения (как например, аминокислоты или витамины) из простых веществ субстрата, то для его развития следует в состав среды ввести готовые аминокислоты или витамины. К таким «требовательным» организмам относятся некоторые виды бактерий (молочнокислые и др.). Актиномицеты и преимущественно почвенные плесневые грибы, как правило, строят вещества своего тела и довольно сложные по химическому составу конечные продукты обмена из соединений, образуемых из простых компонентов субстрата.

Источники азота. Источники азота оказывают важное влияние на образование антибиотических веществ микроорганизмами. На средах с одними источниками азота организмы могут хорошо развиваться, но не осуществляют в данных условиях биосинтеза антибиотика. Например, продуцент антиопухолевого антибиотика аурантина S. auranticus прекрасно развивается на среде, содержащей в качестве единственного источника азота пептон, но при этом не образует антибиотика. Биосинтез аурантина идет на среде с нитратом в качестве источника азота. Обычно в средах для культивирования микроорганизмов в качестве источника азота используют соли азотной, реже соли азотистой кислот, аммонийные соли органических или неорганических кислот, или аминокислоты, белки и продукты их гидролиза (пептоны, гидролизаты). В этих источниках азот находится в окисленной или в восстановленной форме.

В натуральных средах неопределенного состава, содержащих соевую муку, кукурузный экстракт и другие подобные компоненты, азот содержится главным образом в форме белков, питательная ценность которых зависит от наличия у микроорганизмов соответствующих протеаз, расщепляющих эти белки, и определяется тем. насколько легко в процессе ферментативного гидролиза из белков освобождается азот в виде аминокислот и несложных полипептидов, а в конечном счете в форме – NH₂.

Для многих организмов наиболее легко усвояемыми формами азота являются аммонийные соли и аминокислоты, в которых азот находится в восстановленной форме. Так, S. griseus хорошо развивается на средах, содержащих аммонийные источники азота, но не может использовать нитраты в качестве единственного источника азота.

Аминокислоты играют существенную роль в метаболизме мик­роорганизмов. Это объясняется, во-первых, тем, что аминокислоты непосредственно участвуют в синтезе белка (структурного и ферментов) и различных полипептидов; во-вторых, они могут принимать участие в образовании антибиотиков, в том числе и небелковой природы.

Аминокислоты могут оказывать заметное влияние на активность ферментов (индуцировать их образование или репрессировать, подавлять активность). Присутствие в среде одних аминокислот может приводить к образованию других.

Однако многие микроорганизмы с успехом могут использовать и окисленные формы азота, некоторые из них для биосинтеза антибиотика нуждаются именно в нитратном источнике азота (S. auranticus, S. subtropicus и некоторые другие). По всей вероятности, процесс использования нитратов идет через следующие этапы:

NO₃ ® NO₂ ® NH₃ ® Аминокислоты ® Белок

Процесс восстановления нитрата до нитрита идет при участии молибденсодержащего фермента нитратредуктазы. По-видимому, процесс превращения NO₂ в NH₃ происходит через образование азотноватистой кислоты (H₂N₂O₂), гидроксиламина (NH₂OH) и гидрозина (NH₂ – NH₂).

Для ряда актиномицетов нитраты как источники азота иногда усваиваются лучше, чем аммонийные соли. Даже нитриты, если их вносят в среду в небольших количествах, могут использоваться актиномицетами в качестве источников азота. Важно отметить, что использование нитритов тесно связано с источником углерода в среде. Например, в присутствии глицерина нитриты используются гораздо лучше по сравнению с тем, когда в среде присутствует глюкоза.

Доступность того или иного источника азота зависит в основном от химической природы используемого углерода. Так, при развитии S. coelicolor на среде с глюкозой происходит образование органических кислот, в силу чего нитрит, образующийся при восстановлении нитрата, оказывается особенно ядовитым. Если же в среде присутствует аспарагиновая кислота, то ее аминогруппа связывает нитриты и они не оказывают токсического действия.

Использование аммония и некоторых органических источников азота плесневыми грибами в большой степени зависит от наличия в среде органических кислот. Небольшие количества (0,1-0,2 %) дикарбоновых кислот с четырьмя углеродными атомами (например, янтарная, фумаровая) способствуют лучшему усвоению азота. Это, по всей вероятности, связано с тем, что в данном случае легче образуются кетокислоты, которые, в свою очередь, связывают аммиак. В этом виде значительно упрощается включение аммиака в метаболизм грибов.

Определенную роль в развитии организмов и образовании антибиотиков играют также катионы и анионы солей используемых источников азота Например, при одной и той же форме азота могут получиться разные результаты, как в развитии организма, так и в образовании антибиотика. Зависит это от тех особенностей солей, в которых находится данная форма азота, а также от имеющихся в них катионов

Все эти факторы необходимо учитывать при изучении развития микроорганизмов и возможностей образования ими антибиотиков.

В зависимости от источника азота и формы, в которой он при­сутствует в среде, микроорганизм будет в состоянии синтезировать антибиотическое вещество или он будет лишен этой способности.

Так, продуцент стрептомицина не образует антибиотика при развитии на средах с нитратами или нитритами в тех случаях, когда они являются единственными источниками азота. Образование стрептомицина происходит на средах с аммонийными источниками азота. То же самое можно сказать и в отношении продуцента хлортетрациклина – S. aureofaciens.

Биосинтез пенициллина идет более энергично, если в среде наряду с аммонийным источником азота имеется нитратный источник азота.

Альбомицин, выделяемый из культуры S. subtropicus, образуется на среде, содержащей в качестве единственного источника азота KNО₃.

Источники углерода. Благодаря различной химической природе, благодаря неодинаковой степени окисленности, источники углерода сами по себе также оказывают существенное влияние на развитие микроорганизмов и, следовательно, на образование ими антибиотических веществ.

Иногда на одних источниках углерода развитие организма и биосинтез антибиотика происходят хорошо, на других – организм или совсем не развивается, или развивается, но без биосинтеза антибиотика.

Например, B. tnesentericus, выделенный из ризосферы кукурузы, лучше развивается в жидкой синтетической среде при единственном источнике углерода – глюкозе. Щавелевая, яблочная, лимонная и уксусная кислоты непригодны для развития В. tnesentericus и образования антибиотика. При этом наилучшим источником углерода в среде является комбинация двух веществ: глюкозы и аспарагиновой кислоты или глюкозы и молочной кислоты. При раздельном использовании глюкозы, аспарагиновой кислоты или молочной кислоты антибиотическая активность этой культуры значительно ниже.

При развитии P. chrysogenum – продуцента пенициллина – лактоза используется организмом медленнее, чем глюкоза, и это сказывается на выходе антибиотика. Если в среде в качестве источника углерода присутствует только глюкоза, то все обменные процессы, осуществляемые грибом, ускоряются. В этих условиях максимум образования пенициллина происходит приблизительно через 50 часов развития культуры, вследствие чего уровень биосинтеза антибиотика остается низким. В присутствии же лактозы максимум образования антибиотика происходит через 150-160 часов и это способствует повышению выхода пенициллина. Поэтому на практике для получения пенициллина обычно используют одновременно и глюкозу и лактозу, что обеспечивает хорошее развитие гриба и высокий уровень биосинтеза пенициллина.