Генетические методы получения активных продуцентов АБ

Эффективность образования антибиотиков в значительной мере определяется особенностями генотипа штамма-продуцента и с учетом этого обстоятельства исследователями затрачено много усилий на улучшение продуцентов антибиотиков.

Традиционный генетический подход, используемый для увеличения продуктивности антибиотикообразующих организмов всецело основан на случайном мутагенезе и отборе высокопродуктивных штаммов. До недавнего времени скрининг проводили, выращивая клон в жидкой среде и исследуя антибиотическую активность культурального фильтрата. Так как такой скрининг был утомительным и медленным, в одном эксперименте могли исследовать только очень небольшое число клонов. Для увеличения вероятности того, что небольшое число исследованных штаммов будет содержать интересующие мутанты, была необходима индукция большого числа мутаций. У многих таких мутантов имелись нарушения роста. Однако, несмотря на все эти сложности, почти все достигнутые улучшения штаммов, образующих коммерчески важные антибиотики, были получены этим способом, поскольку лучших методов не существовало. Интересно, что степень увеличения продуктивности пенициллина была значительно выше на первых стадиях отбора мутантов. Так, почти 10-кратное увеличение количества секретируемого в среду антибиотика было достигнуто как раз на первых трех стадиях, тогда как для следующего 10-кратного увеличения потребовалось 18 стадий. О биохимической и генетической природе увеличения продуктивности штаммов известно не очень много. Выше уже говорилось, что многие штаммы-суперпродуценты имеют высокую внутриклеточную концентрацию предшественников, а также высокую активность ферментов синтеза предшественников. В дополнение к этому, у штаммов-сверхпродуцентов пенициллина отмечено значительное увеличение ферментов биосинтеза пенициллина. В некоторых случаях установлено, что высокая активность ферментов обусловлена дупликацией генов и генодозируемым эффектом.

Методы классической генетики. Наиболее эффективное применение методов классической генетики в прошлом заключалось в использовании обратного скрещивания штаммов сверхпродуцентов с исходными штаммами для увеличения выносливости мутантных штаммов. Так как традиционный подход к улучшению штаммов включает много стадий с использованием сильных мутагенов и поскольку на каждой стадии в клетке микроорганизма возникает много мутаций, получаемые в результате штаммы сверхпродуцентов являются постоянно ослабленными, плохо растущими и гиперчувствительными к различным стрессам. После обратного скрещивания таких штаммов с диким типом существует вероятность того, что в потомстве клетки унаследуется сверхпродуктивность мутантных штаммов и выносливость штаммов дикого типа.

Сначала это не казалось возможным с Penicillium, не имевшим правильного сексуального цикла, хотя он и относится к эукариотам. Однако возможность образования гетерокарионов в парасексуальном цикле была обнаружена в 1958 г. и использована для улучшения штаммов.

Некоторые штаммы Streptomyces осуществляют коньюгативный перенос ДНК.Во многих случаях гены синтеза антибиотиков представлены в виде кластера. Полагают, что большинство генов биосинтеза антибиотиков Streptomyces локализованы в хромосоме, хотя в ранних работах высказывается мнение, что эти гены содержатся в плазмидах. Так, в геноме Streptomyces делеции очень большого масштаба, около сотен килобаз, встречаются с высокой частотой, и эти делеции часто включают гены образования антибиотиков. Делеции часто сопровождаются интенсивной (свыше 500 раз) амплификацией небольших фрагментов ДНК. Эта частая потеря генов биосинтеза антибиотиков имеет сходство с потерей плазмид, которая вызывает одновременную потерю всех локализованных в ней генов. Другой недавно открытой характерной чертой генома Streptomyces является то, что его хромосома может иногда существовать как линейная ДНК с теломерными последовательностями.

Продуценты антибиотиков часто защищают себя против токсических эффектов своих собственных продуктов. Необходимость в этом особенно актуальна для Streptomyces, образующих антибиотики с антиэубактериальной активностью. Многие виды, образующие антибиотики, обладают механизмами устойчивости к антибиотикам, которые они либо инактивируют в клетке, либо выделяют из клетки. Кроме того, во многих случаях устойчивость к антибиотику обусловлена модификацией его мишени в клетке продуцента. В большинстве изученных случаев гены, ответственные за устойчивость, являются частью кластера гена синтеза антибиотиков; это, вероятно, обеспечивает экспрессию генов устойчивости одновременно с активным синтезом антибиотиков.

Комплементарно адресованный мутагенез. Большой проблемой, усложняющей классическую процедуру, улучшения штаммов-продуцентов антибиотиков, основанную на случайном мутагенезе, является очень низкая вероятность мутирования соответствующих генов и высокая частота появления случайных мутаций в других, неродственных генах. Этих проблем можно избежать с помощью мутагенеза только необходимых участков ДНК.

Один из подходов, решающих эту проблему, разработан Джен-Сианг-Хонгом и Б. Эймсом. При использовании этого подхода вначале получают случайные мутанты трансдуцирующего фага, несущего копию гена, аналогичного тому, который расположен в клетках продуцента рядом с комплексом генов биосинтеза антибиотиков и имеет дефект. Мутантным фагом инфицируют клетки продуцента антибиотика, несущие вышеупомянутый дефектный ген. В инфицированные клетки попадает трансдуцирующая ДНК, которая встраивается в гомологичный сегмент хромосомы, заменяет часть хромосомы в процессе рекомбинации и вводит донорную аллель в дефектный ген продуцента. Наряду с этим в клетки продуцента вносится участок мутированной ДНК, встраивающийся в кластер генов биосинтеза антибиотика. Селекцию полученных мутантов осуществляют на минимальных средах, не содержащих продукта дефектного гена исходного штамма продуцента. Все остальные варианты трансдуктантов, несущих случайные мутации, отбрасываются в процессе селекции.

Если гены образования антибиотиков предполагают клонировать, комплементарно адресованный мутагенез может быть проведен in vitro с последующей трансформацией реципиентных микроорганизмов. Хотя интактные клетки Streptomyces трудно трансформировать, их протопласты (без барьера клеточной стенки), трансформируются легко. Это одна из причин, объясняющих важность клонирования этих генов.

Рациональная селекция. В традиционных методах улучшения штаммов потомство, образующееся после мутагенеза, подвергается скринингу, т.е., просматривая одну за другой все колонии потомства, находят штамм, который образует наибольшее количество антибиотика. Если имеются в распоряжении методы для селекции улучшаемых продуцентов из очень большой популяции потомства, например, 100 миллионов клеток, тогда процесс улучшения штамма достаточно эффективен. Хотя никто еще не предложил общих подходов и общей схемы такой селекции. В каждом конкретном случае используются свои, особые методы селекции. Например, антибиотики пенициллины и тетрациклины способны образовывать хелатные комплексы с ионами тяжелых металлов. Микроорганизмы, образующие эти антибиотики в большом количестве, более устойчивы к ионам тяжелых металлов в среде. Таким образом, селекция мутантов, устойчивых к тяжелым металлам, используется для улучшения штаммов продуцентов пенициллинов.

Биосинтез аминокислот, которые являются исходным материалом для биосинтеза многих антибиотиков, включая (β-лактамы, регулируется обычными механизмами, контролирующими биосинтез первичных метаболитов. Например, биосинтез лизина регулируется при помощи механизма обратной связи конечным продуктом пути биосинтеза, лизином. У Streptomyces, как уже говорилось ранее, лизин является предшественником a-аминоадипиновой кислоты, которая необходима для биосинтеза цефамицина. Таким образом, логично допустить, что предотвращение ингибиции обратной связью биосинтеза лизина увеличит включение углерода в цефамицин. Мутанты, резистентные к ингибированию первого фермента пути биосинтеза лизина обратной связью с конечным продуктом ферментной системы (лизином), могут быть положительно селекционированы выращиванием популяции в минимальной среде в присутствии аналога лизина – 8-(2-аминоэтил)-L-цистеина. Такие мутанты являются сверхпродуцентами лизина и могут образовывать в несколько раз больше цефамицина.

Слияние протопластов. Слияние протопластов представляет собой технику, с помощью которой достигается эффективный внутриклеточный перенос генетического материала в виды, которые образуют антибиотики, но не имеют природных механизмов для конъюгации. Этот метод для биотехнологии антибиотиков имеет важное значение. Исследователи, наконец, получили способ для обратного скрещивания своих мутантов-сверхпродуцентов с родительскими штаммами дикого типа для сохранения выносливости у штамма-продуцента.

Из клеток бактерий или грибов получают протопласты, растворяя их клеточную стенку литическим ферментами. Мембраны двух протопластов сливаются (объединяются) при добавлении к ним высоких концентраций (обычно от 20 % до 35 %) полиэтиленгликоля или другого агента, стимулирующего слияние. Эффективность слияния некоторых штаммов в оптимальных условиях достигает 20 %. Затем клеточные стенки регенерируют в подходящей защитной среде. Обычно хромосомы из двух родительских протопластов подвергаются рекомбинации, а лишний материал окончательно удаляется в процессе успешного клеточного деления. Таким образом, многие потомки этих клеток, сохранившиеся после окончания процесса, имеют только один эквивалент генетического материала, который состоит из смеси генов обоих родителей.

Этот метод можно попытаться использовать также для конструирования новых антибиотиков. Путем слияния клеток двух видов, которые синтезируют различные антибиотики, можно получить потомство клеток, которые содержат два набора генов, синтезирующих антибиотики, и они, возможно, станут синтезировать новый гибридный антибиотик. Среди аминогликозидов и макролидных антибиотиков, например, имеется большое количество минорных вариантов.

Молекулярное клонирование, применяемое для повышения продуктивности и (или) получения новых антибиотиков. Так как гены, ответственные за образование отдельных антибиотиков, имеют тенденцию группироваться в кластеры, некоторые кластеры генов успешно клонировались в плазмидах. Так, например, Ф. Мальпартида и Д. Гопвуд в 1984 г. клонировали гены для всего пути биосинтеза актинородина. Они осуществили это путем скрининга рекомбинантных плазмид в необразующих антибиотик мутантных клетках хозяина. Носителей плазмид, синтезирующих актинородин, отбирали по характерной для актинородина голубой окраске. Плазмида, имеющая вставку около 30 кб, получала полный набор генов – она передавалась всем известным классам мутантов, неспособных к образованию актинородина, и обеспечивала синтез антибиотика этими штаммами. Клонированы кластеры полных наборов генов, кодирующих образование ряда коммерчески важных антибиотиков. Методы доказательства клонирования включал и введение плазмиды в дефектные мутанты, селекцию на устойчивость к антибиотику и использование олигонуклеотидных зондов, соответствующих аминокислотной последовательности изолированных ферментов.

Молекулярное клонирование генов открыло дорогу разнообразным усовершенствованиям коммерческого производства антибиотиков. Один из практических результатов заключается в возможности создания новых соединений. Например, добавление химически синтезированных аналогов к изопенициллин-N-синтетазе, образованной при сверхэкспрессии клонированного гена, привело к образованию новых β-лактамных соединений.

Второй практический результат заключается в конструировании штаммов для образования новых полусинтетических соединений путем введения в клетки желательных генов и инактивации нежелательных. Например, был сконструирован штамм, образующий 7-амино-цефалоспороновую кислоту путем введения в С. acremonium гена цефалоспоринацилазы из Pseudomonas diminuta. Поскольку этот фермент не деацилирует D-аминоадипиновую кислоту боковой цепи цефалоспорина С, в клетки этого продуцента был также введен ген оксидазы D-аминокислот из Fusarium solani для превращения боковой цепи в кетокислоту. Это давало возможность цефалоспориназе деацилировать цефалоспорин С, и штамм при культивировании образовывал 7-амино-цефалоспороновую кислоту. Таким образом, отпала необходимость в использовании сложных химических стадий деацилирования цефалоспорина с целью получения исходного материала для получения многих полусинтетических цефалоспоринов.

Далее исследования по клонированию генов позволили обнаружить возможные пути увеличения выхода антибиотиков при ферментациях. Например, возможно увеличение антибиотической продуктивности путем увеличения числа копий стратегических генов, низкий уровень экспрессии которых создает «узкое место» в пути биосинтеза. Подобного рода подход был удачно использован в случае Cephalosporium acremonium – продуцента цефалоспорина С. Так как этот организм в качестве конечного продукта образует всего лишь около одной трети цефалоспорина по сравнению с образуемым количеством пенициллина N, исследователи предположили, что узким местом является превращение пенициллина N в цефалоспорин при помощи «экспандазы» (деацетокси-цефалоспорин С синтетазы / деацетилцефалоспоринсинтетазы) – оксигеназы, катализирующей превращение пенициллинового ядра в ядро цефалоспорина. Исследователи ввели клонированный ген «экспандазы» в клетки продуцента, который был интегрирован в хромосому, посредством чего увеличилось число его копий. Инженерный штамм синтезировал большее количество цефалоспорина С от 20 % до 40 %. Это коррелировало со значительным снижением секреции пенициллина N этим штаммом, что являлось доказательством успеха экспериментов.

Следующий практический результат заключается в том, что когда антибиотики синтезируются относительно простыми путями, ферменты этих путей могут быть сверхпродуцированы с помощью клонируемых генов и затем перенесены в колоночные реакторы для получения антибиотиков или, по меньшей мере, для получения промежуточных продуктов биосинтеза in vitro. Исследователи проводили подобные эксперименты, получая пенициллины и цефалоспорины в реакторах с иммобилизованными ферментами, используя неочищенные экстракты из микроорганизмов, образующих такие ферменты. Исходным материалом для биосинтеза β-лактамных антибиотиков являются обычно недорогие аминокислоты, поэтому сверхпродукция только одних ключевых ферментов, например, изопенициллин-N-синтетазы могут сделать эти процессы коммерчески выгодными.