Методы генной инженерии

Методы генной инженерии основаны на получении фрагментов исходной ДНК и их модификации.

Для получения исходных фрагментов ДНК разных организмов используется несколько способов:

– Получение фрагментов ДНК из природного материала путем разрезания исходной ДНК с помощью специфических нуклеаз (рестриктаз).

– Прямой химический синтез ДНК, например, для создания зондов.

– Синтез комплементарной ДНК (кДНК) на матрице мРНК с использованием фермента обратной транскриптазы (ревертазы).

Плазми́ды — небольшие молекулы ДНК, физически отдельные от геномных хромосом и способные реплицироваться автономно. Как правило, плазмиды встречаются у бактерий и представляют собой двухцепочечные кольцевые молекулы, но изредка плазмиды встречаются также у архей и эукариот.

В природе плазмиды обычно содержат гены, повышающие устойчивость бактерии к неблагоприятным внешним факторам (в т. ч. устойчивость к антибиотикам), нередко они могут передаваться от одной бактерии к другой (иногда даже к бактерии другого вида) и, таким образом, служат средством горизонтального переноса генов.

Попадание плазмиды в клетку может осуществляться двумя путями: либо при непосредственном контакте клетки-хозяина с другой клеткой в процессе конъюгации, либо путём трансформации, то есть искусственное введение в клетку плазмиды, которому предшествует изменение экспрессии определённого гена клетки-хозяина (приобретение клеткой компетентности).

Искусственные плазмиды используются как векторы в клонировании ДНК, причём благодаря их способности к репликации обеспечивается возможность репликациирекомбинантной ДНК в клетке-хозяине.

Размер плазмид варьирует от 1 до свыше 1000 тысяч пар оснований[1]. Количество идентичных плазмид в пределах одной клетки изменяется от одной до тысяч в зависимости от дополнительных обстоятельств. Плазмиды можно считать частью мобилома, поскольку они часто передаются при конъюгации — механизме горизонтального переноса генов.

Ферменты генетической инженерии – это ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности, и т.д. Рассмотрим основные ферменты генетической инженерии.
Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:

- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.

Трансгенные растения — это те растения, которым «пересажены» гены других организмов.
Картофель, устойчивый к колорадскому жуку, был создан путём введения гена, выделенного из генома почвенной тюрингской бациллы Bacillus thuringiensis, вырабатывающий белок Cry, представляющий собой протоксин, в кишечнике насекомых этот белок растворяется и активируется до истинного токсина, губительно действующего на личинок и имаго насекомых, у человека и других теплокровных животных подобная трансформация протоксина невозможна и соответственно этот белок для человека не токсичен и безопасен. Опрыскивание спорами Bacillus thuringiensis использовалось для защиты растений и до получения первого трансгенного растения, но с низкой эффективностью, продукция эндотоксина внутри тканей растения существенно повысило эффективность защиты, а также повысило экономическую эффективность ввиду того, что растение само начало продуцировать защитный белок. Путём трансформации растения картофеля при помощиAgrobacterium tumefaciens были получены растения, синтезирующие этот белок в мезофилле листа и других тканях растения и соответственно непоражаемые колорадским жуком. Данный подход используется и для создания других сельскохозяйственных растений, резистентных к различным видам насекомых.

33. Классификация изменчивости. Модификационная изменчивость. Норма реакции. Морфозы и фенокопии.

Изменчивость – появление потомков, отличающихся по данному признаку от родительских особей и от родственных особей.

Изменчивость:

Наследственаная:

Комбинативная

Мутационная

Модификационная

Модификационная изменчивость – возникает под влиянием условий внешних среды и является следствием приспособительной реакции генотипа на условии внешней среды в онтогенезе.

Модификация – не связанные с изменением генотипа различия в степени фенотипического проявления одного и того же признака под влиянием меняющихся условий.

Такой тип изменчивости имеет две главные особенности. Во-первых, изменения затрагивают большинство или все особи в популяции и у всех них проявляются одинаково. Во-вторых, эти изменения обычно имеют приспособительный характер. Как правило, модификационные изменения не передаются следующему поколению. Классический пример модификационной изменчивости: растение стрелолист, у которого надводные листья приобретают стреловидную форму, а подводные - лентовидную.

Если у гималайского кролика на спине удалить белую шерсть и поместить его в холод, на этом месте вырастет черная шерсть. Если черную шерсть удалить и наложить теплую повязку, вырастет белая шерсть. При выращивании гималайского кролика при температуре 30°C вся шерсть у него будет белая. У потомства двух таких белых кроликов, выращенного в нормальных условиях, появится "гималайская", окраска. Такая изменчивость признаков, вызванная действием внешней среды и не передающаяся по наследству, называется модификационной. Модификационная изменчивость не затрагивает наследственной основы организма - генотип и поэтому не передается от родителей потомству.

Основные характеристики:

1. Модификации не наследуются;

2. Модификации проявляются у многих особей;

3. Модификации возможны только в пределах нормы реакции (определены генотипом).

Норма реакции – предел изменчивости особей одного генотипа под условием внешней среды. Чем шире норма реакции – тем больше влияние среды и тем меньше влияние генотипа в онтогенезе (тем больше способность организма адаптироваться). Изменчивость признака не может выходить за норму реакции. Например, человек может пробежать 100 м за 11,0 с, 10,0 с, 9,0 с, а вот за 5,0 с не сможет никогда.

Узкая норма реакции – цвет глаз, окраска шерсти. Широкая норма реакции – для количественных признаков.

Для характеристики модификационной изменчивости пользуются статическими показателями: среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, коэффициент вариации.

Графическое отображение проявления модификационной изменчивости — вариационная кривая — характеризует количественный признак и его вариацию. Из кривой видно, что наиболее распространены средние варианты проявления признака (закон Кетле). Причиной этого, по-видимому, является действие факторов окружающей среды на ход онтогенеза. Некоторые факторы подавляют экспрессию генов, другие же, наоборот, усиливают. Почти всегда эти факторы, одновременно действуя на онтогенез, нейтрализуют друг друга, то есть ни уменьшения, ни увеличения значения признака не наблюдается. Это и является причиной, по которой особи с крайними выражениями признака встречаются в значительно меньшем количестве, чем особи со средней величиной. Например, средний рост мужчины — 175 см — встречается в европейских популяциях наиболее часто. При построении вариационной кривой можно рассчитать величину среднеквадратичного отклонения и, на основе этого, построить график среднеквадратичного отклонения от медианы — наиболее часто встречающуюся величину признака.

Фенокопия – изменение фенотипа под влиянием неблагоприятных факторов среды, но по проявлению похожи на мутации. Фенокопии являются результатом действия физических и химических агентов на генетически нормальный организм. Например, при использовании талидомида часто рождались дети с фекомелией – укороченными ластовидными руками, которую могут вызвать и мутантные аллели.

Морфозы – изменение фенотипа вследствие реакции организма на экстремальные факторы внешней среды. Не имеют приспособительного значения. Часто это грубые изменения фенотипа, выходящие за пределы нормы реакции. Морфозы рассматривают как «уродства», которые не наследуются и не носят адаптивного характера. Например, при облучении личинок дрозофилы получают имаго с вырезками в различных частях крыла, которые являются следствием гибели части клеток имагинальных дисков крыла вследствии облучения.

Примеры модификационной изменчивости

У человека:

1) увеличение уровня эритроцитов при подъеме в горы

2) увеличение пигментации кожи при интенсивном воздействии ультрафиолетовых лучей

3) развитие костно-мышечной системы в результате тренировок, шрамы (пример морфоза)

У насекомых и других животных:

1) изменение окраски у колорадского жука вследствие длительного влияния на их куколки высоких или низких температур

2) смена окраски шерсти у некоторых млекопитающих при изменении погодных условий (например, у зайца)

3) различная окраска бабочек-нимфалид, развивавшихся при разной температуре

У растений:

1) различное строение подводных и надводных листьев у водяного лютика, стрелолиста и др.

2) развитие низкорослых форм из семян равнинных растений, выращенных в горах