Профилактическое или лечебное действие сывороток основано на содержащихся в

сыворотке антителах (AT)

Для массового получения сыворотки вакцинируют ослов, лошадей. Введение такой сыворотки дает образование пассивного иммунитета, то есть организм получает готовые антитела. Сыворотки, которые получают путем иммунизации животных должны быть на контроле по такому показателю, как титр антител у животных, чтобы брать у них кровь в период максимального содержания антител. Из крови животных выделяют плазму крови, затем из плазмы удаляют фибрин и получают сыворотку. Это один способ получения сыворотки. Другой способ получения сыворотки - это из культивируемых животных клеток. Однако главной проблемой в этом случае является обеспечение стабильного роста животных клеток. Дело в том, что клетки животных, изолированные из среды организма, часто не делятся in vitro. Для получения положительного результата в этом случае при переносе клеток из организма надо иметь в виду следующие условия этого переноса и его последствия:

1. Нужные нам клетки должны -

• преобладать в культуре,

• быстро адаптироваться к новым условиям,

• быстро расти.
Кроме того:

• должна быть полная стерильность при культивировании,

• питательные среды должны быть стерильными и при их изготовлении должна
быть использована только стерильная вода

2. При росте клеток in vitro, с ними происходят перемены, то есть они:

• теряют способность к дифференциации,

• дегенерируют (перерождаются)

• трансформируются

Все эти перемены происходят с клетками животных вследствие их старения, старения самой
ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2 ►

архитектуры клеток. Если клеточная популяция сможет поддерживаться в гистологической дифференцированной форме, то они сохраняют свою специализацию.

Нормальные живые клетки растут только на поверхности - это так называемые субстрат зависимые клетки, монослойная культура. Клетки могут расти только до полного закрытия поверхности и если поверхности нет, то клетки не растут. В этом случае появляется проблема создания достаточной поверхности для роста клеток. Клетки могут выдерживать не более 50 удвоений, затем они умирают от старости.

Задача роста клеток - этот процесс еще называют пролиферацией - связан с увеличением биомассы за счет того, что число клеток умножается на среднюю массу клеток.

Рост клеток может быть достигнут двумя путями:

• за счет увеличения средней массы - это называется гипертрофия

• за счет увеличения числа клеток - это называется гиперплазия.

Клетки животных обычно в своей массе не увеличиваются, так как их масса удерживается в определенных пределах за счет регуляторных процессов, поэтому, когда говорят о росте животных клеток, то при этом подразумевают только увеличение их числа.

В организме взрослого человека имеется 10¹⁴ клеток и в организме человека ежесекундно происходит 20 делений клеток.

В организме человека имеется система регуляции деления клеток, представляющая собой комбинированный импульс, поступающий, как сигнал, от гормонов желез внутренней секреции и продуктов метаболизма. Если эта система контроля над ростом клеток будет нарушена, то развивается опухоль.

Одной из особенностью многоклеточных животных является степень специализации функций различных клеток тканей и органов, что определяется понятием дифференциации. Таким образом, клетки животных по мере роста зародыша становятся все более специализированными. Это ведет к образованию индивидуальных тканей с вполне конкретными функциями.

Существуют три проблемы роста животных клеток:

1. генетическая нестабильность

2. непостоянство генетических экспрессии

3. старение.

При выращивании животных клеток приходится постоянно отбирать клетки для консервирования.

В процессе развития клеток можно проводить трансформацию - это изменение ростовых свойств культивируемых клеток, что является процессом необратимым и включает генетические изменения этих клеток.

Изменение ростовых свойств клеток является одним из адаптационных процессов, который позволяет размножаться им в неблагоприятных условиях. Благодаря трансформации клетки получают возможность расти in vitro в виде суспензии до высокой плотности популяции этих клеток, что связано с понижением потребности в факторах роста. Трансформация позволяет расти клеткам в условиях, где отношение площади и объема менее благоприятно, чем у нормальных клеток, потому что у трансформированных клеток уже нет субстратной зависимости и геометрический фактор роста не имеет значения.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 3 ►

Что касается старения клетки, то этот показатель является ограничением потенциала деления (всего 50 делений). Если добиться повышенной способности к росту клетки, то это значит, что трансформация преобладает над старением.

Причины старения сводятся к двум моментам:

1. постепенное накопление трансформационных ошибок в следствии вредных влияний
мутаций, когда происходит старение и гибель клетки,

2. генетическая запрограммированность смерти.

В самом процессе биотехнологического культивирования используют, получая после неоднократных пересевов, клеточную линию диплоидных клеток, соблюдая определенную плотность популяции С часть клеток консервируют).

В качестве материала для культивирования можно использовать почки обезьян, почки собак, почки кроликов, куриный эмбрион (возраст -14 дней), клетки легких эмбриона человека (возраст -16 недель). Понятно, что чем моложе материал, тем дольше культивируется клетка.

Весьма важным является и процесс консервирования, как средство сохранения нужного генома и посевного материала клеток с определенным временем роста (сохраняют молодые клетки, являющиеся резервным фондом популяции).

Особенностью животных клеток является то, что они не способны выдерживать лиофилизации и их консервируют только в жидком азоте при температуре минус 196° С. При такой температуре клетки полностью стабильны. Для замораживания используют стеклянные ампулы определенных размеров, например, на 1 миллилитр (мл).

Однако в процессе замораживания могут происходить вредные процессы. Это:

1. образование кристаллического льда в клетке

2. обезвоживание

3. повышение концентрации растворенных веществ.

Возникновение этих вредных процессов во многом зависит от скорости замораживания. Существуют определенные правила замораживания, которые сводятся к следующему:

- нужно использовать ампулы только небольших размеров (на 1 мл),

необходимо внесение криопротекторов (такие, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливинилпропил (ПВП), диметилсульфацил).

- скорость замораживания должна быть одинаковой внутри ампулы и около ее стенки,
например,

лейкоциты охлаждают со скоростью 0,5 -2° в минуту,

фибробласты - 1 -3° в минуту,

клетки эпителия - 2 -10° в минуту.

Восстановление жизненных функций также проводится с определенной скоростью.

Очень важным является и представление о составе питательной среды для культивирования животных клеток. Прежде всего, это 13 незаменимых аминокислот, белков, липидов (из сыворотки), углеводов, витаминов, глюкозы незаменимых жирных кислоты (линолевая, арахидоновая, линоленовая), предшественников простагландинов, неорганических ионов (натрия хлорид (NaCl), калия хлорид (KCI), кальция хлорид (СаСГг) и т. д.,

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 4

микроэлементов (железо, медь, кобальт, цинк, селен и т д. (всего 15). И, наконец, проблемы стерилизации.

стерилизация среды осуществляется мембранным фильтрованием, среду готовят на дистиллированной, стерилизованной воде,

стерилизация оборудования происходит острым паром или химическим способом (если это пластмассовые детали). Режим культивирования осуществляется при определенной температуре, обычно при 37°С.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 4

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 41

Известно, что человек обладает иммунной системой для защиты от воздействия внешних неблагоприятных факторов, биологически активных агентов. В качестве таких агентов выступают клетки микроорганизмов, вирусы, белки, нуклеиновые кислоты, антибиотики, пестициды, объединенные под общим названием антигенов. Понятие антиген является общим, так как обозначает определенную химическую структуру, против которой могут быть получены антитела. На самом деле антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получившим название антигенных детерминант (эпитопы).

Например, в случае белковых молекул антигенными детерминантами являются участки поверхности, содержащие всего около пяти аминокислотных остатков. В случае бактериальных клеток в качестве антигенных детерминант часто выступают короткие цепочки из 3-5 остатков Сахаров, образующих стенку бактерий. Что касается низкомолекулярных соединений, например, некоторые лекарства, то сами по себе они не могут вызывать образование антител. Их называют гаптенами. Однако после присоединения гаптенов к поверхности какой-либо макромолекулы, организм начинает вырабатывать антитела (иммуноглобулины животных и человека). Антитела (иммуноглобулины) это главный компонент иммунохимической реакции. Причем, даже малые размеры гаптена по отношению к объему полости активного центра антитела не являются препятствием для образования высокоспецифических антител, хотя гаптен в этом случае связывается лишь с частью специфических участков активного центра антитела. Как пример, можно привести структуру молекул двух гормонов - тироксина и тиронина, которые отличаются всего лишь одним атомом йода, а вырабатываемые антитела против них различаются по константам связывания более чем в 1000 раз.

Антигены внешней среды поступают в организм человека с воздухом, водой, пищей, через слизистые и кожные покровы. Часть антигенов может попадать к человеку в виде вакцин и иммуномодулирующих лекарственных средств (агентов).

Иммуномодуляторы либо усиливают, либо ослабляют иммунный ответ организма, поэтому они могут быть подразделены на иммуностимуляторы и иммуносупрессоры. Иммунный ответ это сложный процесс межклеточного взаимодействия различных типов лимфоидных клеток с участием специфических гормонов, в результате чего так называемые В-клетки активно синтезируют специфические антитела против данного антигена.

Способы усиления иммунного ответа по типу воздействия можно различать не только как активные и пассивные, но и как специфические и неспецифические.

Например, к группе активных специфических препаратов можно отнести вакцины, полученные на основе либо рекомбинантных протективных антигенов, либо живых гибридных носителей. К группе препаратов для образования пассивного иммунитета (неспецифической иммуностимуляции) относят рекомбинантные интерлейкины, интерфероны и другие цитокины и, наконец, имеется группа препаратов с иммуносупрессивной активностью, появление которых в клинической практике в начале 60-х годов было связано с необходимостью подавления реакции отторжения тканей при трансплантации органов и лечении аутоиммунных заболеваний. К препаратам, вызывающим супрессию специфического иммунного ответа к какому-либо

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2 ►

аутоантигену относятся толерогены. Их получают, конструируя из рекомбинантных антигенов и неиммуногенных носителей, комплекс которых позволяет подавлять специфический LgE-ответ к аллергену. Используя рекомбинантную технологию, можно выделить LgE-связующие молекулы из экстрактов аллергенов, отвечающих за гиперергические реакции, для создания на их основе толерогенов. Иммуносупрессивная терапия имеет существенные достижения в области специфического пассивного воздействия на иммунную систему. Например, при коньюгации цитостатика или токсина с антителами (иммунотоксины) можно осуществить направленный транспорт лекарственного средства к определенному рецептору клетки, к конкретной субпопуляции клеток, например, к Т-хелперам.

Кроме того, антиидиотипические антитела могут быть мишенью для аутоантител, с помощью которых можно влиять на течение аутоиммунного заболевания, нивелируя его симптомы, корректируя нарушения свертывающей системы крови.

Методы пассивной иммуносупрессии включают и специфическую плазмоиммуносорбцию, которая используется при тяжелых формах аллергических заболеваний. С их помощью можно удалять из крови больного глобулины и аллергеноспецифические антитела.

В современной фармацевтической биотехнологии кроме иммуномодуляторов и иммуносупрессоров значительное место отводится лекарственным и диагностическим препаратам, получаемым на основе медиаторов иммунной системы.

Медиаторы иммунологических процессов, являющиеся в обобщенном виде полипептидными факторами неиммуноглобулиновой природы, называются цитокинами. Так белки, синтезируемые лимфоцитами, называют лимфокинами, а макрофаги и моноциты -монокинами. Иммуномедиаторы - это единая функциональная совокупность, обеспечивающая в гомеостазе созревание и дифференцировку Т- и В-клеток, регулируя их пролиферативную активность.

Как правило, количество медиаторов в организме не велико и они быстро инактивируются. С помощью биоинженерии удалось решить проблему получения интерлейкина -1 и -2 для группы Т-клеточных лимфокинов, а также медиаторов семейства интерферонов.

Показанием к терапии служит эндогенный дефицит интерлейкина -2 (после трансплантации костного мозга, при цитостатической терапии). Методы генной инженерии и рекомбинантной техники позволили получить препараты всех классов имнтерферонов. Положительные результаты применения интерферонов были получены при лечении вирусных заболеваний и отдельных видов опухолей (в онкологии).

Изучение медиаторов, принимающих активное участие в иммунном ответе, требует высокочувствительных методов их определения, основанных на использовании моноклональных антител.

Весьма существенным является то, что клоны антител могут храниться в замороженном состоянии. В любое время можно взять определенную дозу такого клона и ввести животному, у которого будет развиваться опухоль, продуцирующая моноклональные антитела заданной специфичности. Вскоре в сыворотке животного будут обнаружены антитела и в очень высокой концентрации, от 10 до 30 мг/мл. Клетки такого клона можно также выращивать in vitro, а секретируемые ими антитела получать из культуральной жидкости. В

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 3

настоящее время гибридомная техника получила широкое применение. Например, моноклональные антитела можно определить как химический реагент известной структуры, который всегда можно получить в случае необходимости, в то время как соответствующая антисыворотка является вариабельной смесью реагентов и никогда не может быть воспроизведена в точности после гибели исходного животного.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 42

Получение антител. Отвечая на этот вопрос, надо знать что такое иммунный ответ. Иммунный ответ это сложный процесс межклеточного взаимодействия различных типов лимфоидных клеток с участием специальных гормонов, в результате чего так называемые В-клетки активно синтезируют специфические антитела против данного антигена.

Моноклональные антитела с успехом применяются для дифференциальной диагностики многих инфекционных и неинфекционных заболеваний, а также для стандартизации определения групп крови путем иммунохимического анализа. Именно с помощью моноклональных антител были идентифицированы индивидуальные маркеры многих возбудителей инфекционных заболеваний как вирусной, так и бактериальной природы, клеток крови, опухолей, гормонов и т.д. Изучение генетических механизмов многих заболеваний стало возможным благодаря уникальной специфичности моноклональных антител. Так методом иммуносцинтиграфии опухолей можно идентифицировать локализацию опухоли с ее метастазами размером 0,5-1,0 см.

Самыми важными областями использования иммунохимического анализа являются:

- контроль банков крови и продуктов из донорской крови;

- обнаружение возбудителей в объектах внешней среды;

- диагностика инфекционных заболеваний;

- диагностика диабета.

Иммунодиагностические тест-системы с использованием поликлональных антител созданы практически для всех лекарственных препаратов, но в настоящее время имеется тенденция на использование моноклональных антител, так как они являются практически чистыми реагентами, обладают стабильными характеристиками и доступны в неограниченных количествах, что помогает совершенствовать иммуноанализ в целом.

Сегодня количество проводимых иммунохимических анализов в мире растет настолько стремительно, что производство иммунодиагностикумов совместно с приборами и вспомогательными материалами можно рассматривать уже как отдельную, самостоятельную область биотехнологической промышленности. Моноклональные тела диагностического назначения представлены сегодня на фармацевтическом рынке в мире широким ассортиментом наборов.

Схема получения моноклональных тел заключается в следующем. Синтетическим коньюгированным антигеном иммунизируют мышей. Лимфоциты из селезенки мыши сливают с помощью полиэтиленгликоля с клетками стабильной миеломной линии. Из полученных гибридных клеток отбирают только те, которые унаследовали от клеток селезенки способность продуцировать антитела к лекарственному средству, а от миеломных клеток - способность неограниченно расти в культуре. После соответствующего культивирования получают клон клеток, продуцирующих антитела к лекарственному препарату. Этот клон клеток можно выращивать на мышах в виде асцитных опухолей и из асцитной жидкости выделяют антитела.

С большим успехом в гинекологическую практику вошел экспресс-метод определения беременности по уровню хориогонического гонадотропина в моче. Такие типы тестов могут быть использованы не только в специальных лабораториях, но и в домашних условиях

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2

самостоятельно. В качестве практического примера использования твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA- enzyme linked immunosorbentassay) можно рассмотреть метод определения хорионического гонадотропина. В этом методе на полистерольные шарики сорбируются моноклональные антитела к хорионическому гонадотропину (АГ, определяемое вещество). К сенсибилизированным шарикам добавляют исследуемую пробу (мочу) и коньюгат из маркера и моноклональных антител (AT- меченные пероксидазой), к другой детерминанте гормон).

В результате иммунологической реакции хорионический гонадотропин связывается одной детерминантой с моноклональными антителами, иммобилизованными на поверхности шариков, а другой - с моноклональными антителами коньюгата с маркером (фермент-пероксидаза). Затем шарики отмывают от всех не связавшихся компонентов мочи и определяют активность фермента в составе иммунных комплексов с помощью субстратхромогенной смеси. Степень окраски раствора будет прямо пропорциональна количеству хорионического гонадотропина в образце мочи.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1

Задача 43

Система врожденного иммунитета связана непосредственно с молекулярным механизмом антимикробного действия. Известно, что одна из важнейших групп лейкоцитов - это фагоцитирующие клетки: моноциты, макрофаги, полиморфноядерные нейтрофилы. Они способны связывать микроорганизмы на своей поверхности, затем поглощать и уничтожать их, что является следствием простого неспецифического механизма распознавания и связывания чужих микробных продуктов (ксенобиотиков), или проявлением врожденного иммунитета. В этом отношении фагоциты можно рассматривать как первый рубеж линии защиты против инфекции. Если на ранних стадиях инфекции преобладают механизмы врожденного иммунитета, то на поздних стадиях инфекеции лимфоциты осуществляют уже специфический ответ приобретенного иммунитета. Они способны «запоминать» возбудителя «вспоминать» его, действуя быстро и эффективно.

Особое место в профилактике инфекционных заболеваний занимают рекомбинантные вакцины. Получение рекомбинантных вакцин., как и любых рекомбинантных белков связано с методами генной инженерии. В этом случае необходимо получить изолированный нужный ген из микроорганизма, применив такой тип мутации как делеция (деления - это выделение участков хромосом или нескольких генов). Выделенный ген должен отвечать за определенные фрагменты антигена. Если такой ген вставить в клетку, используя соответствующий вектор (плазмида + ген), то эта клетка сможет воспроизводить эту же антигенную структуру, которую кодирует включенный в нее ген.

В качестве конкретного примера можно привести получение рекомбинантной вакцины гепатита В. Как известно, вирус гепатита В не размножается in vitro, то есть в искусственных условиях. Для получения вакцины гепатита В выделенный ген этого вируса вставляют в дрожжевую клетку или в клетку E.coli. Затем уже промышленным способом эту культуру выращивают в ферментере на обогащенных питательных средах в аэробных условиях, получая значительные количества рекомбинантного белка, содержащего антиген вируса гепатита В. Введение такой вакцины приводит к образованию антител против гепатита В и создает иммунную защиту организма человека от этого тяжелого заболевания.

Врожденный иммунитет играет большую роль в проблемах трансплантологии.Организм имеет способность отторгать трансплантант как ксенобиотик, потому, что этот трансплантант несет антиген, отсутствующий у реципиента. Осуществляется принцип реакции «хозяин против трансплантанта». Реакцию трансплантант против хозяина (РТПХ) можно преодолеть и подавить тщательно типируя донора и рецепиента, удаляя зрелые Т-клетки (лимфоидные клетки, образуемые из стволовых клеток со способностью реагировать на антиген) из трансплантанта и, конечно, применяя иммуносупрессоры, например, циклоспорин А.

Сравнительно новым направлением в развитии и создании новых лекарственных агентов являются ингибиторы сигнальной трансдукции, как БАВ. Они обеспечивают передачу сигнала от рецепторов на поверхности клетки к ядерным факторам транскрипции с последующей активацией тех или иных генов. С экспрессии этих генов начинается ответ клетки на внешнее воздействие. Среди агентов такого рода, в числе прочих, обнаружены иммунодепрессанты, которые необходимы в трансплантологии, обеспечивая ее успех.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 44

Радиационная стерилизация лекарственных средств.

Как следует из представленного в указанной лекции материала, биосинтез лекарственных препаратов ведется в асептических условиях. При выделении, очистке и получении лекарственных форм также соблюдаются максимально возможные предосторожности против контаминации. Тем не менее, проблема стерильности инъекционных препаратов и обсемененности препаратов для наружного применения остается одной из самых сложных для производства лекарственных средств. Приводим в краткой форме некоторые данные о методе радиационной стерилизации, считая в тоже время, что сфера ее приложения, в основном -нестандартные ситуации, создающиеся при обнаружении нестерильных уже расфасованных серий препаратов.

Определенные виды ионизирующей радиации допустимы для стерилизации лекарственных средств. Соответствующие указания имеются в официальных фармакопейных документах.

Хорошо известно, что ионизирующей радиацией стерилизуются хирургические инструменты, резиновые перчатки, шприцы одноразового пользования и т.п.

Рассмотрим вопросы, связанные с радиационной стерилизацией лекарственных препаратов. Сразу же следует подчеркнуть, что при такой стерилизации (в минимальных дозах) загрязняющие препарат микроорганизмы теряют способность к размножению и гибнут вследствие повреждения ДНК- происходят сшивки между нуклеотидами, а также разрывы ДНК.

При термической стерилизации (в отличие от радиационной) происходит денатурация многих белков клетки, в результате чего повреждения ее становятся более многочисленны.

При стерилизации путем мембранной фильтрации (с использованием ультрафильтров) микробные клетки не убиваются, а удаляются из лекарственного препарата. В реальных условиях радиационная или лучевая (жаргонный термин) стерилизация используется на отдельных производствах. Это происходит иногда ввиду объективных трудностей при внедрении технологии получения нового препарата, а иногда по экономическим причинам.

Давно установлено, что стерилизующая доза ионизирующего облучения - 2,5 миллиона рад, то есть 2,5 мегарад (2,5 Мрад); 1 рад, или 1 rad (radiation absorbed dose) соответствует 100 эрг/г.

Фармацевт должен занимать грамотную и достаточно четкую позицию в отношении бытующей радиофобии, конкретно выражающейся в том, что радиационная стерилизация может, якобы, привести к наведенной радиоактивности облученных препаратов.

Разрешенные для стерилизации лекарств - гамма лучи изотопа кобальта (кобальта шестьдесят) и быстрые электроны с энергией не выше пяти миллионов электроновольт, получаемые на ускорителях, наведенной радиации у обработанных ими препаратов вызвать не могут, независимо от поглощенной дозы облучения, так как неспособны вызвать расщепление атомного ядра.

Гамма-лучи (Со⁶⁰) распространяются в воздухе на несколько десятков метров, в воде - на несколько десятков сантиметров, в свинце - на несколько сантиметров. На промышленной установке защитный слой воды, окружающий герметическую стерилизационную камеру, где

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2 ►

находятся стандартные стержни с (Со⁶⁰), длиной до одного метра и упаковки со стерилизуемым лекарственным препаратом, должны составлять несколько метров. Стерилизационная камера снабжена автоматизированным дистанционным управлением, позволяющим вдвигать в нее и удалять из нее стержни с кобальтом, разъединяя, таким образом, источник облучения и упаковки со стерилизуемым препаратом.

Режим стерилизации обычно подбирается с таким расчетом, чтобы стерилизующая доза (2,5 Мрад) набиралась облучаемым препаратом примерно за сутки. При этом следует иметь ввиду, что период полураспада (Со⁶⁰) составляет около пяти лет. Естественно, что работа на установках с радиоактивным кобальтом постоянно требует особых мер предосторожности.

Установка, где для стерилизации используются быстрые электроны во многом принципиально отличается от указанной выше. Проникающая способность электронов, разогнанных до разрешаемого для стерилизации лекарств показателя, невелика. Электроны не могут "пронизать" несколько рядов флаконов или ампул. Однако, чтобы набрать стерилизующую дозу (2,5 Мрад), требуются секунды или доли секунд. Флаконы подаются по одному с помощью транспортера к соответствующему "окошку", набирают стерилизующую дозу и двигаются дальше.

При выключении стерилизационная установка такого рода становится абсолютно безопасной в отношении радиации. Значительный опыт по радиационной стерилизации биотехнологических препаратов накоплен на примере антибиотиков. Стерилизации подвергались расфасованные по флаконам лиофильно высушенные субстанции, соли антибиотиков и их препараты с различного рода наполнителями. В ряде случаев препараты искусственно заражались различными видами микроорганизмов и их спорами. Доза 2,5 Мрад (гамма лучи кобальта, быстрые электроны) обусловливала гарантированную стерильность. Облученные препараты сохраняли активность и удовлетворяли фармакопейным тестам. При сравнении их с необлученными препаратами можно выявить некоторые отличия. Так, белые (бесцветные) порошки теряли "блестящий" оттенок и приобретали матовый. Разница обнаруживалась только при непосредственном сравнении. Порошки красного цвета (актинолицины) и желтого (тетрациклины) приобретали несколько более тусклый оттенок, что тем не менее не сказывалось на активности самого препарата. Можно говорить о несколько худшем товарном виде препаратов, но не о том, что они не соответствуют фармакопейным требованиям. Это характерно для большинства проверенных антибиотиков (природные и полу синтетические пенициллины, аминогликозиды, тетрациклины и ряд других). Исключение составляли полиены, то есть структуры с сопряженными двойными связями - например, нистатин, который при облучении заметно терял активность.

Специалист с фармацевтическим образованием должен быть знакомым с применением радиационной стерилизации: в случае расфасованных во флаконы и ампулы препаратов, предназначенных для инъекций. Под влиянием облучения изменяется кристаллическая решетка стекла. Оно темнеет, мутнеет и приобретает, таким образом, непривлекательный, с коммерческой точки зрения вид, хотя полностью сохраняет свои функциональные качества. Потемнение обратимо, но при комнатной температуре это происходит медленно - в течение ряда месяцев. Не выпускать облученные препараты в течение такого срока в аптечную сеть -значит, сократить для потребителя срок годности облученных серий. Теоретически для

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 3

изготовления флаконов и ампул можно использовать стекло с некоторыми редкоземельными элементами (марки стекла такого типа применяются в военной технике). Однако, это стекло слишком дорого для изготовления из него сотен миллионов единиц стандартных изделий.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 45

Промышленное производство рекомбинантного инсулина

Инсулин, как вы знаете, является регулятором углеводного обмена. В организме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса поджелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развивается такое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет - 1 типа). При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваются патологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает при дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы в клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарный диабет.

Следующий вопрос, который надо рассмотреть, это структура инсулина. Итак, инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей: А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков. В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков

Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина. Рис.

При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина,

так называемый проинсулин. Этот проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида,

состоящего из 35 аминокислотных остатков.

С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в

активный инсулин.

Есть разные способы получения инсулина. Мы остановимся на получении инсулина

биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода. Итак, преимущества

получения инсулина биосинтетическим путем.

До внедрения в промышленность метода получения инсулина с использованием рекомбинантных микроорганизмов существовал только один способ получения инсулина - из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней. Инсулин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота отличается от инсулина человека на 3 аминокислотных остатка, а инсулин, получаемый из железы свиньи, только на один аминокислотный остаток, то есть он ближе к человеческому инсулину. Тем не менее, при введении белков, отличающихся по структуре от белков человека даже в таком незначительном выражении, возможно возникновение аллергических реакций. Такой инсулин, как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови образующимися антителами.

Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата). С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же количесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli.

Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х годов (восьмидесятых годов). Остановимся на схеме получения рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli- Эли-Лилли,

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2 ►

Соединенные Штаты Америки):

1. этап Путем химического синтеза были созданы последовательности нуклеотидов,
которые кодируют образование А и В цепей, то есть были созданы синтетические
гены.

2. 11 этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят
ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

3. 111 этап. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот
ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться бурной репликации
плазмид.

Рис.

4. 1У этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli - кишечной палочки и
получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-

цепь.

5. V этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу,
которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды
активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов,
синтезирующих АиВ цепи.

6. VI этап. Клетки лизируют, выделяют АиВ цепи, которые связаны с
бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от
бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение АиВ цепей.

7. VII этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.

Инсулин, полученный этим путем является человеческим инсулином по своей структуре. Применение современных методов очистки исключает наличие в инсулине эндотоксинов и пирогенных примесей.