Сигнальные молекулы системы quorum sensing. Основу системы QS составляют сигнальные молекулы

Основу системы QS составляют сигнальные молекулы. Это вещества обладают различной химической структурой и физико-химическими свойствами [Camilli A.Bacterial small-molecule signaling pathways. / Camilli A, Bassler B L. // Science. – 2006. – V. 311. – P. 1113-1116., Deziel E. Analysis of Pseudomonas aeruginosa 4-hydroxy-2-alkylquinolines (HAQs) reveals a role for 4-hydroxy-2-heptylquinoline in cell-to-cell communication. / Deziel E, Lepine F, Milot S, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2004. – V. 101. – P. 1339-1344.]. Сигнальных молекул, которые используются в системе QS у микроорганизмов относятся к следующим группам соединений (рис. 12):

1. Аминокислоты – ацилированные гомосерин лактоны грамотрицательных бактерий

2. Пептиды – линейные и циклические сигнальные пептиды грамположительных бактерий

3. Гетероциклические соединения – 4-гидрокси-2-гептилхинолон P. aeruginosa, сигнальные фураноны, γ-бутиролактон бактерий рода Streptomyces.

4. Алифатические соединения – фарнезол Candida albicans.

Некоторые из представленных соединений синтезируются только одной определённой группой или видами, тогда как другие, например сигнальные фураноны, встречаются у широкого спектра микроорганизмов и, по-видимому, играют роль молекул межвидовой коммуникации [Andres F. Autoinducer 2 Controls Biofilm Formation in Escherichia coli through a Novel Motility Quorum-Sensing Regulator (MqsR, B3022) / Andres F. Gonzalez Barrios, Rongjun Zuo, et al. // Journal of Bacteriology. –2006. – V. 188. – No. 1. – P. 305–316.]. Так же, некоторые виды микроорганизмов синтезирует только один тип сигнальных молекул системы QS, тогда как другие могут использовать в этих целях несколько групп соединений.

Рис. 12. Структура основных сигнальных молекул системы quorum sensing.

У грамотрицательных бактерий наиболее распространенной группой сигнальных молекул являются ацилированные гомосерин лактоны (АГЛ). АГЛ представляют собой производные гомосерина замещённый по NH₂-группе ацильным радикалом различной длинны (рис. 13). Минимальное количество углеродных атомов у известных сегодня АГЛ равняется 4, таким образом, самым коротким сигнальным гомосерин лактоном является N-бутирил гомосерин лактон P. aeruginosa [Winson Michael K. Multiple N-acyl-L-homoserine lactone signal molecules regulate production of virulence determinants and secondary metabolites in Pseudomonas aeruginosa (autoinducers/quorum sensing/gene regulation) / Michael K. Winson, Miguel Camara, Amel Layifi, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1995. – V. 92. – P. 9427-9431]. АГЛ грамотрицательных бактерий делятся на две группы – нормальные АГЛ и 3-оксо или 3-гидрокси производные. Последние имеют дополнительный заместитель по третьему углеродному атому ацильной цепи в виде О= в случае 3-оксо или ОН- в случае 3-гидрокси производных. Все АГЛ представлены L-стереоизомерами. Все природные АГЛ имеют четное количество атомов углерода в ацильной цепи, обычно от 4 до 14. Существуют и синтетические АГЛ с нечётным числом атомов углерода. Такие производные являются сильными ингибиторами АГЛ-зависимой системы QS [Reverchon S. New syntheticanalogues of N-acyl homoserine lactones as agonists or antagonistsof transcriptionalregulators involved in bacterial quorum sensing. / Reverchon S., Chantegrel R, Deshayes C., et al. // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2002. – V. 12. – P. 1153-1157.]. АГЛ с ненасыщенной ацильной цепью, например N-C₁₄ и 3-гидрокси-С₁₄-АГЛ могут подвергаться цис - транс изомерии.

Рис. 13. Структурные формулы некоторых АГЛ.

Предшественниками АГЛ является S-аденозилметионин (предшественник гомосеринлактона) и ацетил-ацетат (предшественник ацильной цепи). Биосинтез гомосеринлактона (рис. 14) происходит путём отщепления остатка метионина от предшественника по сульфидной связи, и дальнейшего его превращения в гомосерин. В результате реакции образуется гомосеринлактон и высокотоксичное соединение метилтиоаденозин. Оно инактивируется путём гидролиза с помощью фермента Pfs (метилтиоаденозин\S-аденозилгомоцестеин нуклеазы) с образованием менее токсичной метилтиорибозы и аденина [More M.I. Enzymatic synthesis of a quorum-sensing autoinducer through use of defined substrates. / More M.I., Finger D.L., Stryker J.L, et al. // Science. – 1996. – V. 272. – P. 1655-1658.].

Рис. 14. Биосинтез сигнальных молекул микроорганизмов.

Биосинтез ацильной цепи происходит в цикле элонгации жирных кислот с помощью ферментов семейства Fab [Hoang Tung T. b-Ketoacyl acyl carrier protein reductase (FabG) activity of the fatty acid biosynthetic pathway is a determining factor of 3-oxo-homoserine lactone acyl chain lengths. / Tung T. Hoang,. Sarah A. Sullivan,. John K. Cusick and Herbert P. Schweizer. // Mcrobiology. – 2002. – V. 148. – P. 3849-3856.]. В результате работы цикла элонгации образуется группа интермедиатов – 3-оксо\гидрокси-С_(n)-ацетилфосфаты и N-C_(n)-ацетилфосфаты (где n – количество атомов углерода). Эти интермедиаты переносятся с помощью специальных I-белков (ацетилфосфаттрансферазами\АГЛ-синтетазами) на молекулу гомосеринлактона. В результате получаются АГЛ с различной длиной ацильной цепи. Катаболизм АГЛ осуществляется путём гидролиза (рис. 15). У микроорганизмов имеются в наличии две группы ферментов разрушающие АГЛ – лактоназы и ацилазы [Huang L.L. Utilization of acyl-homoserine lactone quorum signals for growth by a soil pseudomonas and Pseudomonas aeruginosa PA01. / Huang L.L., Han J. I., Zhang L. H., Leadbetter J. R. // Applied and Environmental Microbiology. – V. 69. – P. 5941-5949., Sio Charles F. Quorum Quenching by an N-Acyl-Homoserine Lactone Acylase from Pseudomonas aeruginosa PA01. / Charles F. Sio, Linda G. Otten, Robbert H. Cool, et al. // Infection and Immunity. – 2006. – V. 74. – № 3. – P. 1673-1682.]. В первом случае гидролиз молекулы АГЛ идёт по лактонному кольцу с образованием ацил-гомосерина, во втором, с восстановлением NH₂- группы гомосеринлактона и отделением соответствующей жирной кислоты.

Рис. 15. Пути инактивации молекул АГЛ

Молекулы АГЛ обладают цитотоксичностью по отношению к клеткам эукариот. Так, показано что 3-оксо-додеканоил-гомосеринлактон P. aeruginosa вызывает апоптозоподобную клеточную смерть нейтрофилов человека, а так же способен влиять на уровень синтеза провосполительных цитокинов [Shiner Erin K. Interkingdom signaling: Deciphering the language of acyl-homoserine lactones / Erin K. Shiner, Kendra P. Rumbaugh, Simon C. Williams. // FEMS Microbiology Reviews. – 2005. – V. 29. – P. 935-947.].

Сигнальные молекулы грамположительных бактерий представлены сигнальными пептидами. Сигнальные пептиды в зависимости от вида микроорганизмов могут находиться в линейной или циклической форме (обычно в виде пептид-тиолактона). К циклическим сигнальным пептидам относятся, например AgrD1 и AgrD2 Staphylococcus aureus. К линейным – низин Lactococcus lactis. Сигнальные пептиды состоят из небольшого числа аминокислотных остатков. Так, упомянутый выше низин состоит из 34 аминокислот (рис. 16). Молекула низина стабилизируется за счёт –S- связей между 3 и 7, 8 и 11, 13 и 19, 23 и 26, 25 и 28 аминокислотными остатками. Низин является одним из самых крупных сигнальных пептидов. Для сравнения AgrD1 состоит всего лишь из 7 аминокислот, СomX Bacillus subtilis – 6 аминокислот, и т. д [Quorum sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction systems in Gram-positive bacteria. Michiel Kleerebezem,¹* Luis E. N. Quadri,² Oscar P. Kuipers¹ and Willem M. de Vos^1,3. mololecular Microbiology (1997) 24(5). 895-904, Structure of the Bacillus subtilis quorum-sensing peptide pheromone ComX Masahiro Okada1, Isao Sato1, Soo Jeong Cho2, Hidehisa Iwata1, Toshihiko Nishio1, David Dubnau2 & Youji Sakagami1, Nature Chemical Biology 1, 23 - 24 (2005)]. Особенностью B. subtilis является наличие второго сигнального пептида – субтилина. Он состоит из 32 аминокислотных остатков и относится к линейным пептидам.

Биосинтез сигнальных пептидов осуществляется с единой ДНК матрицы (рис. 13). В ходе трансляции образуется полипептид, состоящий из повторяющихся аминокислотных последовательностей, соответствующих структуре того или иного сигнального пептида. Далее, получившейся полипептид нарезается на отдельные сигнальные молекулы. Такая нарезка может осуществляться или в цитоплазме клеток с участием специфических пептидаз, или в момент выхода полипептидной последовательности из клетки. Во втором случае пептидазный домен входит в состав специфического транспортёра [Quorum Sensing in Staphylococci Richard P. Novick and Edward Geisinge. Annu. Rev. Genet. 2008. 42:541–64].

Рис. 16. Строение некоторых сигнальных пептидов грамположительных бактерий.

Многие линейные сигнальные пептиды обладают значительной антимикробной активностью. Такие сигнальные пептиды получили название лантибиотики или не фаговые бактериоцины [Quorum sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction systems in Gram-positive bacteria. Michiel Kleerebezem,¹* Luis E. N. Quadri,² Oscar P. Kuipers¹ and Willem M. de Vos^1,3. mololecular Microbiology (1997) 24(5). 895-904,]. Примерами лантибиотиков могут служить названные выше низин и субтилин, а так же эпидермин S. epidermidis. Наиболее изученным среди них является низин, чей механизм действия основан на нарушении синтеза клеточной стенки за счёт связывания с липидом ІІ а так же формировании пор в клеточной стенки мишеней [Lipid II as a target for antibiotics Eefjan Breukink & Ben de Kruijff. Nature Reviews Drug Discovery 5, 321-323 (April 2006)].

Сигнальные фураноны, как указывалось выше, встречаются как у грамотрицательных, так и у грамположительных бактерий. Эти соединения получили название аутииндуктор-2 (АИ-2). АИ-2 был впервые описан у V. harveyi при изучении работы системы QS у этого микроорганизма [Cao, Jie-Gang; Meighen, Edward A. (1989). "Purification and structural identification of an autoinducer for the luminescence system of Vibrio harveyi". Journal of Biological Chemistry 264 (36): 21670–21676]. Дальнейшие исследования показали, что АИ-2 имеет очень широкое распространение в природе. Под АИ-2 сегодня понимаются два родственных соединения – 2,2,6,6а-тетрагидрокси-3а-фуранон и его борированное производное 2,2,6,6а-тетрагидрокси-3а-фурано[3,2-d][1,3,2]дигидроксоборолан-2-уид (фуранозил борат диэстер). Второе соединение уникально тем что, оно входит в небольшое число биологически активных природных веществ содержащих бор. Фуранозил борат диэстер встречается исключительно у представителей рода Vibrio, тогда как не борированый АИ-2 у многих микроорганизмов [Sun Jibin Sun. Is autoinducer-2 a universal signal for interspecies communication: a comparative genomic and phylogenetic analysis of the synthesis and signal transduction pathways. / Jibin Sun, Rolf Daniel, Irene Wagner-Döbler, An-Ping Zeng. // BMC Evolutionary Biology. – 2004. – V. 4. – P. 1-11.].

Биосинтез АИ-2 осуществляется тем же путём что и АГЛ, однако в процессе синтеза наблюдается ряд существенных отличий (рис. 17.).

Рис. 17. Биосинтез аутоиндуктора-2.

Предшественником АИ-2, так же как и АГЛ, является S-аденозилметионин. Однако в отличие от последних гидролиз этого соединения происходит не сразу. В начале от предшественника с помощью метилтрансферазы отщепляется метил и образуется S-аденозилгомоцистеин. Затем, фермент Pfs отщепляет аденин с образованием S-рибозилгомоцистеина. С помощью фермента LuxS от интермедиата отщепляется гомоцистеин и образуется 4,5-дигидрокси-2,3-пентандион (ДПД), который является непосредственным предшественником АИ-2. Не содержащий бор АИ-2 образуется из ДПД в ходе обратимой реакции, тогда как фуранозил борат диэстер образуется из не борированного АИ-2 в присутствии B(OH)₄^-, с выделением воды. Последняя реакция является не обратимой, и, скорее всего, носит не ферментативный характер [Sun Jibin Sun. Is autoinducer-2 a universal signal for interspecies communication: a comparative genomic and phylogenetic analysis of the synthesis and signal transduction pathways. / Jibin Sun, Rolf Daniel, Irene Wagner-Döbler, An-Ping Zeng. // BMC Evolutionary Biology. – 2004. – V. 4. – P. 1-11.].

Для P. aeruginosa важнейшей сигнальной молекулой является 4-гидрокси-2-гептилхинолон (PQS – P seudomonas Q uinolon S ignal). Это соединение представляет собой хинолон, замещённый по второму положению ацильным остатком, содержащим семь атомов углерода. Биосинтез этого соединения (рис. 18) осуществляется двумя путями [Biosynthetic Pathway of Pseudomonas aeruginosa 4-Hydroxy-2-Alkylquinolines Florian Bredenbruch,1 Manfred Nimtz,2 Victor Wray,2 Michael Morr,1 Rolf Müller,3, and Susanne Häussler1*. Journal of Bacteriology, June 2005, p. 3630-3635, Vol. 187, No. 11]. Предшественником PQS в обоих случаях является антраниловая кислота. В ходе основного пути биосинтеза две молекулы антраниловой кислоты конденсируются с образованием хинолона, к которому затем присоединяется активированная энантовая кислота. В случае альтернативного пути биосинтеза, антраниловая кислота реагирует с оротиевой кислотой. При этом образуется промежуточный продукт – киннуриновая кислота, к которой затем присоединяется активированная капроновая. Реакция конденсации антраниловой и оротиевой кислоты идёт с выделением мочевины. Все реакции основного и альтернативного пути

Рис. 18. Основной и альтернативный пути биосинтеза ацил-хинолонов [Biosynthetic Pathway of Pseudomonas aeruginosa 4-Hydroxy-2-Alkylquinolines Florian Bredenbruch,1 Manfred Nimtz,2 Victor Wray,2 Michael Morr,1 Rolf Müller,3, and Susanne Häussler1*. Journal of Bacteriology, June 2005, p. 3630-3635, Vol. 187, No. 11].

биосинтеза PQS осуществляются ферментами кодируемыми генами pqs ABCDE [Biosynthetic Pathway of Pseudomonas aeruginosa 4-Hydroxy-2-Alkylquinolines Florian Bredenbruch,1 Manfred Nimtz,2 Victor Wray,2 Michael Morr,1 Rolf Müller,3, and Susanne Häussler1*. Journal of Bacteriology, June 2005, p. 3630-3635, Vol. 187, No. 11]. В связи с высокой алкалифильностью и размерами PQS не способен диффундировать через мембрану клеток, а выделяется в составе мембранных везикул [Kadurugamuwa J.L. Natural release of virulence factors in membrane vesicles by Pseudomonas aeruginosa and the effect of aminoglycoside antibiotics on their release / Kadurugamuwa J.L, Beveridge T.J. // J. Antimicrob. Chemother. – 1997. – V. 40. – P. 615-621.].

PQS выполняет ряд важнейших функций в поддержании работы системы межклеточной коммуникации у P. aeruginosa. В частности он является переключателем между двумя основными звеньями QS синегнойной палочки, а так же дополнительно регулируют биосинтез ряда продуктов контролируемых системой [Diggle Stephen P. The Pseudomonas aeruginosa 4-Quinolone Signal Molecules HHQ and PQS Play Multifunctional Roles in Quorum Sensing and Iron Entrapment. / Stephen P. Diggle, Sandra Matthijs, Victoria J. Wright, et al. // Chemistry & Biology. – 2006 – V. 14. – P. 87-96.]. Так же как и АГЛ, PQS характеризуется определённой степенью цитотоксичности для клеток эукариот, а так же обладает иммуномодулирующей активностью [Hooi Doreen S. W. Differential Immune Modulatory Activity of Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signal Molecules. / Doreen S. W. Hooi, Barrie W. Bycroft, Siri Ram Chhabra, et al. // Infection and immunity. – 2004. – V. 72. – № 11. – P. 6463-6470.].

Алифатические сигнальные молекулы в основном распространенны среди низших эукариот. Характерным примером такой сигнальной молекулы является фарнезол Candida albicans. Фарнезол представляет полиненасыщенный моноатомный спирт имеющий во 2,6 и 10 положении метильные заместители. Это соединение синтезируется в пути биосинтеза эргостерола (рис. 19).

Рис. 19. Биосинтез фарнезола у Candida albicans.

В ходе биосинтеза из ацетил-СоА впоследствии ряда превращений образуется геранил пирофосфат. Из этого продукта под действием фермента фарнезил пирофосфат синтетазы образует интермедиат фарнезил пирофосфат. Часть интермедиата через сквалин и ланостерол превращается в эргостерол, а часть выводится из метаболического пути и уходит на биосинтез ряда метаболитов, в том числе и фарнезола [Sato, T., T. Watanabe, T. Mikami, and T. Matsumoto. 2004. Farnesol, a morphogenetic autoregulatory substance in the dimorphic fungus Candida albicans, inhibits hyphae growth through suppression of a mitogen-activated protein kinase cascade. Biol. Pharm. Bull. 27:751–752]. Фарнезол регулирует образование псевдогифов у C. albicans, а так же способен инактивировать некоторые звенья QS бактерий. Существуют так же данные о способности фарнезола подавлять рост раковых клеток [Burke, Y. D., M. J. Stark, S. L. Roach, S. E. Sen, and P. L. Crowell. 1997. Inhibition of pancreatic cancer growth by the dietary isoprenoids farnesol and geraniol. Lipids 32:151–156.].