Типы систем quorum sensing. С точки зрения структурно-функциональной организации на сегодня выделяют два основных типа систем QS – систему аутоиндукции и систему сигнальной трансдукции

. С точки зрения структурно-функциональной организации на сегодня выделяют два основных типа систем QS – систему аутоиндукции и систему сигнальной трансдукции

Система аутоиндукции является основным типом системы QS у грамотрицательных бактерий. В качестве сигнальных молекул в ней используются АГЛ. Система аутоиндукции (рис. 20) состоит из двух типов

Рис. 20. Схема функционирования системы аутоиндукции.

белков – I и R. I-белок представляет собой АГЛ-синтетазу (ацетилфосфат трансферазу), который отвечает за синтез сигнальных молекул. R-белок является рецептором для АГЛ. Эти белки относятся к Lux-семейству названному так в связи с их первичным обнаружением в качестве регуляторов биолюминесценции у V. Fisheri.

Система аутоиндукции функционирует следующим образом. Синтезированные с помощью I-белка сигнальные молекулы выводятся из клеток путём диффузии и накапливаются во внешней среде. По достижению определённой пороговой концентрации молекулы АГЛ поступают обратно в клетки (так же с помощью диффузии) и связываются с R-белками. R-белки относятся к классу внутриклеточных рецепторов, которые, связываясь со своими лигандами (АГЛ) приобретают функциональную активность. Связывание АГЛ с рецепторами приводит к образованию АГЛ-R комплексов, которые мултимеризуються за счёт дополнительного взаимодействия между ацильными хвостами сигнальных молекул. Образующиеся мультимерные комплексы n(АГЛ-R) обладают полимеразной активность и обуславливают экспрессию генов-мишеней. Среди генов-мишеней комплексы n(АГЛ-R) индуцируют экспрессию генов кодирующих І и R, поддерживая накопление новых АГЛ и рецепторов к ним, то есть аутоиндуцируют работу системы QS Примером системы основанной на принципе аутоиндукции является система QS у P. aeruginosa.

У P. aeruginosa роль сигнальных молекул выполняют два АГЛ – 3-оксо-додеканоил гомосерин лактон и N-бутирил-гомосерин лактон, а так же упоминавшийся выше PQS. Гены системы QS у этого микроорганизма представлены тремя группами – las, rhl, и pqs. Каждая из этих групп генов обеспечивает синтез и ответ на свою сигнальную молекулу.

В инактивированном состоянии система QS у P. aeruginosa находится под негативным контролем трёх белков репрессоров - RsmA, RpoS и QscR, которые предупреждают раннюю активацию.

На ранних этапах активации системы в клетках накапливается гуанизин-3’,5’-бисфосфат (ppGpp) который синтезируется с помощью белка RelA. Накопление этого продукта приводит с одной стороны к инактивации белков репрессоров, а с другой к активации ранних регуляторных генов, таких как mva T. Продукт этого гена, в свою очередь, активирует синтез белка Vfr. Vfr является непосредственным активатором системы QS у P. aeruginosa. Работа системы начинается с активации las -звена (рис. 20). Vfr индуцирует гены las I (3-оксо-додеканоил-гомосерин лактон) и las R (рецептор). Это сопровождается повышением концентрации 3-оксо-С₁₂-АГЛ, и по достижении определённого порогового уровня он начинает связываться со своим рецептором. Получившийся комплекс активирует гены las -, а также rhl - и pqs -. Активация rhl - и pqs - приводит к появлению N-C₄-АГЛ и PQS, а так же рецепторов к ним. Далее система переходит в самоподдерживающееся состояние и начинается экспрессия генов-мишеней. las - звено системы QS P. aeruginosa контролирует биосинтез эластазы (ген las B), Las-протеазы (ген las А), токсина А (ген tox A), лектинов (lec A, lec B), сидерофоров и др. rhl -звено контролирует синтез рамнолипидов (rhl ABC), НСN, пиоцианина (phn A, phn B) и др. pqs -звено выполняет функцию переключателя между предыдущими двумя звеньями, а так же выполняет функцию дополнительного контроля биосинтеза выше описанных продуктов

Таким образом, система QS у P. aeruginosa основана на использование нескольких последовательно появляющихся сигнальных молекул. Последние данные указывают на то, что роль сигнальной молекулы так же выполняет пиоцианин]. Так, исследования показали, что пиоцианин способен активировать фактор транскрипции SoxR и тем самым осуществлять положительную регуляцию mex GHI- opm D (efflux) и моноксигеназы с неизвестной функцией (ген PA2274. Поскольку, по сегодняшним представлениям пиоцианин не вызывает появление сигнальных молекул более низкого порядка, а лишь вызывает опосредованную экспрессию некоторых генов, это вещество можно считать терминальным сигналом системы QS у P. aeruginosa.

Система сигнальной трансдукции, характерная для грамположительных микроорганизмов характеризуется более сложной структурной организацией, чем система аутоиндукции (рис. 22). В качестве сигнальных молекул в данной системе используются пептиды. Работа системы сигнальной трансдукции кардинально отличается от предыдущей.

Как указывалось выше, биосинтез сигнальных пептидов происходит с общей матрицы в виде полипептида. Процессинг молекулы полипептида у большинства микроорганизмов осуществляется в момент выхода этих молекул из клетки. В отличие от АГЛ грамотрицательных бактерий, этот полипептид из-за своих размеров не способен к диффузии и его выведение из клетки осуществляется с помощью механизмов активного транспорта. Транспорт синтезированного полипептида осуществляется с помощью сложного АТФ-зависимого кассетного транспортёра. Этот транспортёр содержит как минимум три функциональных домена: домен А представляет собой канал, через который проходит молекула полипептида; домен В – АТФ-аза, обеспечивающая функционирование транспортёра и домен С – пептидазный домен, который осуществляет процессинг полипептидной цепи. Таким образом, в межклеточном пространстве накапливаются молекулы сигнальных пептидов. При достижении пороговой концентрации сигнальные пептиды, в отличие от АГЛ, не поступают внутрь клеток микроорганизмов, а связываются со специфическими рецепторами на поверхности клеток микроорганизмов. Эти рецепторы через трансмембранный домен ассоциированы с сенсорными киназами (обычно гистидин киназой). Связывание сигнального пептида с рецептором приводит к активации сенсорной киназы, которая фосфорилирует белок-регулятор. Активированный белок-регулятор приобретает полимеразную активность и активирует экспрессию генов-мишеней

Примером системы, основанной на принципе сигнальной трансдукции, является система QSубактерий рода Staphylococcus.

Компоненты системы QS у бактерий рода Staphylococcus кодируются agr локусом. Экспрессия данного локуса находится под контролем двух различных промоторов, P2 и P3. Под контролем промотора Р2 находится 4-х генный оперон, который составляет основу системы QS: agr A-D. Продукты этих генов распределяются следующим образом:

1. agr A – ген, который кодирует регулятор ответа

2. agr B – ген, который кодирует компоненты АТФ-зависимого кассетного транспортёра\экзопептидазы

3. agr C – ген, который кодирует гистидин киназу

4. agr D – ген, кодирующий предшественник сигнальных пептидов

Предшественник сигнальных пептидов поддаётся процессингу как с N- так и С- конца с образованием тиолактона между центральным цистеином и С-концом сигнального пептида. AgrB представляет собой трансмембранную экзопептидазу и играет ключевую роль в образовании сигнальных пептидов AgrD связывается с мембраной за счёт своего N-конца, тогда как взаимодействие с AgrB осуществляется с помощью С-конца молекулы-предшественника. При этом происходит разрыв молекулы с С-конца при участии видоизмененных остатков гистидина и цистеина, которые впоследствии катализируют образование тиолактонного кольца. Процессинг N-терминального конца осуществляется с помощью сигнальной протеазы SpsB

AgrC является характерным представителем класса 10 рецепторных гистидин киназ]. Белок содержит два домена: N-концевой трансмембранный сенсорный домен, и С-концевой цитоплазматический киназный домен. При этом С-концивой домен является крайне консервативным, тогда как N-концевой домен, который содержит детерминанты специфичности – очень вариабельным. Однако исследования многочисленных agr -мутантов показало, что за нормальное функционирование рецепторного домена отвечает лишь не большое число аминокислотных остатков. Эти аминокислотные остатки, особенно находящиеся в позиции 100-116, по-видимому, и обуславливают связывание специфических лигандов Цитоплазматический киназный домен AgrC является димером, в котором мономеры соедененны промежуточной областью из 6 аминокислотных остатков. Домен подвергается транс-аутофосфориллированию в процессе переноса фосфата на белок-эффектор и, таким образом, не отличается от большинства бактериальных гистидин-протеинкиназ. Как указывалось выше, для киназного домена характерна высокая консервативность. Практически любые мутации как в структуре киназного домена, так и в структуре белка- эффектора ведут к стойкому снижению эффективности переноса фосфата, в связи с нарушением комплиментарности

Белок-эффектор AgrA является ярким примером бактериального регулятора ответа. Этот белок обладает способностью к высокоаффинному связыванию с agr -промотором

]. Добавление высокоэнергетического донора фосфатов улучшает подобное связывание. Это свидетельствует о том, что AgrA является функционально активным лишь в фосфориллированной форме. При этом, AgrA приемушественно связывается с P2 промотором, образуя более сильную и стабильную связь, чем с Р3. Исходя из этого, можно предположить, что активация Р2 предшествует активации Р3 промотора. Сайтом узнавания и связывания для активированного AgrA являются гептануклиотидные повторы в последовательности промоторов. Подобное характерно и для белков-эффекторов других грамположительных бактерий. У S. aureus AgrA часто взаимодействует с другим регуляторным белком – SarA, который так же связывается с Р2 промотором. Такое взаимодействие, по-видимому, приводит к совершенствованию экспрессии как Р2 так и Р3 промоторов

Кроме AgrA, роль эффектора agr системы QS у бактерий рода Staphylococcus выполняет короткая РНК состоящая из 514 нуклеотидов – РНК ІІІ. Она представляет собой регуляторную РНК со сложной вторичной структурой (рис. 23), и временем жизни более 45 минут.Она кодирует амфифильный пептид, состоящий

из 26 аминокислот, который является δ-гемолизином и не выполняет регуляторных функций, однако является важным фактором клеточной коаггрегации и созревания биоплёнки. Интересным является то, что среди бактерий рода Staphylococcus наблюдаются некоторые вариации в последовательности нуклеотидов в РНК ІІІ, однако сохраняется неизменность в организации вторичной структуры, результатом чего является кросс-реактивность между видами. Функции РНК ІІІ достаточно разнообразны. 3’-конец молекулы является репрессором биосинтеза гена белка А (sap). Не перекрытые субрегионы на 5’ и 3’ концах РНК III способны регулировать транскрипцию генов α-гемолизина (hla). Таким образом, первичная и единственная функция РНК III в качестве регуляторной молекулы, это регуляция трансляции индивидуальных экзобелков и плеотропных регуляторов. Так, позитивная регуляция биосинтеза α-гемолизина этой молекулой осуществляется путём противодействия блокированию считывания hla мРНК, но при этом сама является ингибитором трансляции белка А и фибрин-связывающего белка, который кодируется геном SA1000, путём перекрывания регионов инициации трансляции в мРНК обоих белков. Так же показано, что РНК III с помощью того же механизма способна ингибировать трансляцию Rot-регулятора Между РНК III и rot мРНК возникают как минимум два контакта по принципу «петля-петля», причём, в месте одного из них происходит интеграция петли РНК III в последовательность rot мРНК, что приводит к блокированию связывания rot мРНК с рибосомой. Последнее событие (ингибирование биосинтеза Rot-регулятора) приводит к выключению agr системы QS, но так как agr и rot перекрываются лишь частично, по-видимому, должен существовать ещё один, не описанный пока белок-регулятор, который в случае ингибирования синтеза Rot способен осуществлять негативную регуляцию генов agr

Так же как и в случае системы QS у P. aeruginosa, под контролем agr у бактерий рода Staphylococcus находится достаточно значительное количество продуктов и признаков. Сюда входит синтез факторов патогенности, вторичных метаболитов, различных поверхностных и экзобелков, образование биоплёнки и многое другое. В дополнении к agr системе QS, у бактерий рода Staphylococcus, как и у многих других грамположительных бактерий существует система, основанная на использовании АИ-2, которая будет описана ниже.

Системы аутоиндукции и сигнальной трансдукции являются базовыми системами коммуникации у бактерий. Однако значительная разница в строении и принципах функционирования этих двух систем не позволяет использовать их для межгрупповой коммуникации. Межгрупповая коммуникация у бактерий осуществляется за счёт наличия дополнительной, построенной на использовании АИ-2 системе QS.

Как было описано выше, под понятием АИ-2 сего подразумевают два родственных соединения, различные по своей химической структуре. Эти различия накладывают свой отпечаток на принципе функционирования системы QS, основанной на использовании АИ-2. Сегодня выделяют три типа структурно-функциональной организации таких систем, которые сочетают в себе черты как системы аутиоиндукции, так и системы сигнальной трансдукции:

1. АИ-2-QS система бактерий семейства Enterobacteriaceae – в качестве сигнальной молекулы используется 2,2,6,6а-тетрагидрокси-3а-фуранон.

2. АИ-2-QS система бактерий семейства Vibrionaceae – в качестве сигнальной молекулы используется фуранозил борат диэстер.

3. «Двухкаскадная» система QS у V. harveyi – для регуляции экспрессии генов одновременно используются фуранозил борат диэстер и гомосерин лактоны.

Примером системы первого типа является система QS у бактерий рода Salmonella (рис. 24). Она представлена генами семейства lrs. В это семейство входят гены, которые кодируют сложный трансмембранный АВС транспортёр (lrsА, lrsВ, lrsС), ген lrsК, кодирующий киназу, lrsR, который кодирует белок-регулятор ответа и lrsI, ответственный за биосинтез АИ-2. Синтезированные молекулы АИ-2 свободно диффундируют через цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку бактерий и по достижении определённой концентрации связываются с LrsВ, который является рецепторным доменом АВС транспортёра. Это связывание приводит к тому, что LrsА изменяет свою конформацию, заставляя LsrC

открыть трансмембранный канал. По этому каналу молекулы аутоиндуктора 2 попадают внутрь клетки бактерий и связываются с киназой LsrK, которая фосфориллирует сигнальные молекулы. Данное событие необходимо для их активации. Активированные таким образом АИ-2 связываются с LsrR, который приобретает полимеразную активность и активирует экспрессию генов мишеней

У бактерий рода Vibrio АИ-2-QS система функционирует иначе (рис. 24). У этих бактерий гены системы QS составляют семейство lux. Синтезированный с помощью LuxS АИ-2 диффундирует из клеток микроорганизмов. При достижении клетками определённой численности, АИ-2 связывается со специфическим рецептором на поверхности клетки, который ассоциирован с киназой\фосфотазой LuxQ. В отсутствии АИ-2 LuxQ проявляет киназную активность и фосфориллирует белки LuxU и LuxО, которые в фосфориллированном состоянии являются ингибиторами экспрессии LuxR-полимеразы. Связывание АИ-2 на поверхности клеток приводит к тому, что LuxQ изменяет свою конформацию. Это приводит к изменению активности этого фермента с киназной на фосфотазную и дефосфориллированию LuxU и LuxО, которые при этом теряют свои репрессорные свойства и индуцируют биосинтез LuxR. Накопление последнего и обуславливает активацию генов мешеной.

«Двухкаскадная» система QS у V. harveyi (рис. 25) устроена более сложно. Эта система в своей структуре объединяет систему аутоиндукции грамотрицательных бактерий и второй тип организации АИ-2-QS системы. В клетках V. harveyi одновременно

синтезируются АИ-2 в виде фуранозил борат диэстера и гомосерин лактоны. АИ-2, как было описано выше, индуцирует биосинтез LuxR, которая у этого микроорганизма в отличие от других членов семейства не проявляет полимеразных свойств. Полимеразные свойства этот белок приобретает только после связывания с гомосерин лактонами, которые свободно диффундируют из окружающей среды в клетки V. harveyi.