Методы лабораторной диагностики при отравлении фосфорорганическими соединениями

Ферментативный метод определения ФОС.

Материальное обеспечение: Раствор №1. Берут 200мг бромтимолового синего и растирают в ступке с 20мл 0,1 н. раствора едкого натра до растворения. Синий раствор из ступки перено­сят в литровую мерную колбу. В нее вливают 50мл 0,1 М раствора борной кислоты в 0,1 М растворе хлори­стого калия и доводят дистиллированной водой до 1л. Раствор должен иметь интенсивно-синюю окраску и рН 8,4.

Раствор №2. К 9,75мл раствора №1 добавляют 0,25мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. Раствор до­лжен иметь желтое окрашивание и рН 3,5.

Раствор №3. К 1,8мл раствора №1 добавляют 0,2мл 1%-ного раствора ацетилхолинхлорида (9:1).

Принцип метода основан на определении интенсивности угнетения активности ацетилхолинэстеразы при инку­бации нормальной сыворотки крови лошади, экстракта из патматериала и раствора ацетилхолинхлорида. Сте­пень угнетения фермента устанавливают по изменению окраски бромтимолового синего под воздействием обра­зующейся уксусной кислоты от синей до зеленовато-желтой.

Ход анализа. К 25г измельченной навески до­бавляют 25мл бензола и экстрагируют при помешива­нии в течение 1ч. 0,025мл экстракта микропипеткой вводят в уленгутовскую пробирку. Туда же добавляют 0,025мл лошадиной сыворотки крови и 2мл раствора №3. Одновременно готовят колориметрический стан­дарт (раствор №2) и контроль. В контрольную пробир­ку вместо экстракта заливают дистиллированную воду. По скорости изменения окраски, от интенсивно-синего до желтого, в пробирке с исследуемым экстрактом, по срав­нению с контролем, определяют наличие или отсутствие фосфорорганического пестицида в пробе.

Этот метод используют для определения остатков ДДВФ, диброма, циодрина; после концентрирования экстрактов — хлорофоса и амидофоса.

Оценка результата:

· Угнетение активности холинэстеразы на 10% и более свидетельствует о наличии ФОС в исследуемом материале.

· Степень угнетения фермента устанавливают по изменению окраски бромтимолового синего под действием уксусной кислоты (образуется в результате расщепления ацетилхолинхлорида) отсинего до зеленовато-желтого.

Определение ФОС в воде и кормах.

Гидроперекисная реакция (реакция Шанемана) основана на способности ФОСувеличивать скорость окисления бензидина и других окислительно-восстановительных индикаторов. Механизм реакции - под действием перекиси водорода на ФОС образуются гидроперекиси этих соединений, которые в щелочной среде (обеспечивает наличие натрия цитрат) осуществляют окисление бензидина.

В тех случаях, когда окраска слабо выражена (при определении как в кормах так и в воде), к содержанию пробирки добавляют 0,5 мл толуола и тщательным образом смешивают.

Оценка результата:

под действием перекиси водорода на ФОС образуются гидроперекиси этих соединений, которые в щелочной среде (обеспечивает наличие натрия цитрат) осуществляют окисление бензидина, что проявляется появлением желто-оранжевой окраски.

В тех случаях, когда окраска слабо выражена (при определении как в кормах так и в воде), к содержанию пробирки добавляют 0,5 мл толуола и тщательным образом смешивают. При наличии ФОС слой толуола принимает желтую или желто-оранжевую окраску. Чувствительность реакции 10-100 мг на 1 кг корма.

Экспресс-метод определения отравления пчел ФОС.

Принцип метода. Метод основан на свойстве эстераз гидролизовать α-нафтиловый эфир уксусной кислоты, промежуточный продукт распада которого α-нафтол с солью прочный синий Б образует вещество, придающее жидкости окрашивание.

Метод является качественным и позволяет определить отравление пчел фосфорорганическими ядохимикатами в течение 9-30 дней после их гибели.

Ход анализа. Отбирают 10 погибших пчел и отделяют у них головы, растирают их в ступке с порошком стекла, добавляют 4 мл физраствора и переносят в пробирку. Аналогичным образом готовят контрольный гомогенат голов от 10 здоровых пчел и обе пробирки после встряхивания оставляют на 5-10 мин для отстаивания.

Оценка результата:

Положительный результат анализа считается установленным в том случае, если раствор, содержащий 1-нафтиловый эфир уксусной кислоты и соль прочного синего Б, в течение 2 минут после внесения гомогената голов погибших пчел не приобретает розовую окраску.