Методы генной инженерии

Методы генной инженерии основаны на получении фрагментов исходной ДНК и их модификации.

Для получения исходных фрагментов ДНК разных организмов используется несколько способов:

– Получение фрагментов ДНК из природного материала путем разрезания исходной ДНК с помощью специфических нуклеаз (рестриктаз).

– Прямой химический синтез ДНК, например, для создания зондов (см. ниже).

– Синтез комплементарной ДНК (кДНК) на матрице мРНК с использованием фермента обратной транскриптазы (ревертазы).

Определение нуклеотидного состава фрагментов ДНК по классической методике производится с помощью радиоактивных зондов – молекул ДНК с заранее известной структурой, в состав которых входят радиоактивные изотопы фосфора или водорода. Если структура выделенного фрагмента хотя бы частично комплементарна структуре зонда, то происходит ДНК-ДНК-гибридизация, и на микрофотографии препарата появляется засветка от радиоактивного изотопа. В настоящее время для определения нуклеотидных последовательностей ДНК широко используют флуоресцентные метки.

Выделенные участки ДНК встраивают в векторы переноса ДНК. Векторы ДНК – это небольшие молекулы ДНК, способные проникать в другие клетки и реплицироваться в них.

В состав вектора ДНК входит не менее трех групп генов:

1. Целевые гены, которые интересуют экспериментатора.

2. Гены, отвечающие за репликацию вектора, его интеграцию в ДНК клетки-хозяина и экспрессию требуемых генов.

3. Гены-маркеры (селективные, репортерные гены), по деятельности которых можно судить об успешности трансформации (например, гены устойчивости к антибиотикам или гены, отвечающие за синтез белков, светящихся в ультрафиолетовом свете).

Для внедрения векторов в прокариотические или эукариотические клетки используют различные способы:

1. Биотрансформация. Используются векторы, способные сами проникать в клетки. Частным случаем биотрансформации является агробактериальная трансформация.

2. Микроинъекции. Используются, если клетки, подлежащие трансформации, достаточно крупные (например, икринки, пыльцевые трубки).

3. Биобаллистика (биолистика). Векторы «вбивают» в клетки с помощью специальных «пушек».

В качестве векторов часто используют плазмиды (кольцевые молекулы ДНК прокариотических клеток), а также ДНК вирусов. У эукариот в качестве векторов используют мобильные генетические элементы – участки хромосом, способные образовывать множество копий и встраиваться в другие хромосомы. В составе одного вектора можно комбинировать различные фрагменты ДНК (различные гены). Вновь образованные фрагменты ДНК называют рекомбинантными.

Векторы переноса ДНК вместе с внедренными фрагментами ДНК различными способами вводят в прокариотические или эукариотические клетки и получают трансгенные клетки. В ходе размножения трансгенных клеток происходит клонирование требуемых фрагментов ДНК, в частности, отдельных генов. Клонированные гены эукариот подвергают различным модификациям (например, добавляют перед ними определенные промоторы) и внедряют в клетки-продуценты. Основная проблема состоит в том, чтобы чужеродные гены экспрессировались постоянно, то есть должен происходить синтез необходимых веществ без ущерба для клетки–хозяина.

Практические достижения современной генной инженерии заключаются в следующем:

– Созданы банки генов, или клонотеки, представляющие собой коллекции клонов бактерий. Каждый из этих клонов содержит фрагменты ДНК определенного организма (дрозофилы, человека и других).

– На основе трансформированных штаммов вирусов, бактерий и дрожжей осуществляется промышленное производство инсулина, интерферона, гормональных препаратов. На стадии испытаний находится производство белков, позволяющих сохранить свертываемость крови при гемофилии, и других лекарственных препаратов.

– Созданы трансгенные высшие организмы (многие растения, некоторые рыбы и млекопитающие) в клетках которых успешно функционируют гены совершенно других организмов. Широко известны генетически модифицированные растения (ГМР), устойчивые к высоких дозам определенных гербицидов, а также Bt -модифицированные растения, устойчивые к вредителям.

– Разработаны методы клонирования строго определенных участков ДНК, например, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР-технологии применяются для идентификации определенных нуклеотидных последовательностей, что используется при ранней диагностике некоторых заболеваний, например, для выявления носителей ВИЧ-инфекции.

Генная инженерия относится к технологиям высокого уровня (high technology). В противоположность технологиям низкого уровня, высокие биотехнологии характеризуются высокой наукоемкостью, т.е. использованием рабочих систем, полученных с использованием самых современных методов экологии, генетики, микробиологии, цитологии, молекулярной биологии. Материалы, применяемые в высоких биотехнологиях, часто нуждаются в специальной подготовке. Для реализации таких технологий требуется специальное технологическое оборудование, обслуживаемое квалифицированными специалистами. Из-за нехватки таких специалистов расширение высокотехнологичного производства сопровождается его автоматизацией и компьютеризацией.

ГМ-технологии (GM-technology) используются как в рамках обычного сельскохозяйственного производства, так и в других областях человеческой деятельности: в здравоохранении, в промышленности, в различных областях науки, при планировании и проведении природоохранных мероприятий.

Любые технологии высокого уровня могут быть опасными для человека и окружающей его среды, поскольку последствия их применения непредсказуемы. Поэтому технологии генной инженерии (GM-technology) вызывают у населения вполне понятное недоверие.