Дослід 2. Кількісне визначення активності каталази в крові

Принцип методу. Каталаза – фермент класу оксидоредуктаз, що каталізує розщеплення гідрогену пероксиду на воду і оксиген:

каталаза

2 Н₂О₂ 2Н₂О + О₂

Метод базується на визначенні кількості гідрогену пероксиду, перетвореного ферментом за певний проміжок часу. Гідроген пероксиду розкладається каталазою, а його надлишок відтитровують за присутності сульфатної кислоти:

5H₂O₂ + 2 KMnO₄ + 3 H₂SO₄ → K₂SO₄ + 2 MnSO₄ + 8 Н₂О + 5О₂

Матеріальне забезпечення: розведена кров (1:1000), дистильована вода, 1%-ний розчин Н₂О₂, 10 % розчин сульфатної кислоти, 0,1 н розчин КМnO₄, колбочки, піпетки, бюретка.

Хід роботи. Розведену кров (1:1000) наливають по 1 мл у дві колбочки, додають по 7 мл дистильованої воли, в дослідну пробу додають 2 мл 1 % Н₂О₂, а в контрольну – 5 мл 10 % розчину сульфатної кислоти. Дія каталази в кислому середовищі припиняється (у контрольній пробі), оскільки її рН оптимум – 7,4. Колбочки залишають на 30 хв. при кімнатній температурі. Потім до дослідної проби додають 5 мл 10 % розчину Н₂SO₄, а до контрольної – 2 мл 1 % р-ну Н₂О₂. Вміст колбочок титрують 0,1н р-ном КМnO₄ до появи стійкого рожевого забарвлення.

Каталазне число (Кч) розраховують за формулою:

Кч= (А-В) x 1,7

А – кількість мл 0,1 н р-ну КМnO₄, яка пішла на титрування контрольної проби;

В – кількість в мл 0,1 н р-ну КМnO₄, яка пішла на титрування дослідної проби.

У нормі каталазне число становить 10-15 одиниць.

Каталазне число – це кількість гідрогену пероксиду (мг), що розкладається в 1 мкл досліджуваної крові.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Біологічна роль каталази полягає у захисті організму від шкідливого впливу гідрогену пероксиду, який утворюється при внутрішньоклітинному окисненні різних сполук.

За умов норми каталазне число становить в крові 10-15 одиниць. Однак визначення каталазного числа без одночасного визначення кількості еритроцитів є недоцільним, оскільки кількість фермента є залежною від кількості еритроцитів. Тому в клініці використовують не каталазні числа, а показник каталази, в якому чисельником є каталазне число, а знаменником – кількість еритроцитів в 1 мл крові. Цей показник становить у нормі 2-3´10^-6.

Висока активність каталази спостерігається при перніціозній анемії та інших макроцитарних анеміях, при введенні в організм кофеїну, ацетонових тіл, алкоголю. Пониження активності ферменту спостерігається при злоякісних пухлинах, інфекційних захворюваннях, таких як черевний тиф, скарлатина, малярія, туберкульоз легень.