Динаміка мембран. Рухливість фосфоліпідних молекул у мембранах

Режим функціонування мембрани сильно залежить від: мікров'язкості ліпідного бішару і рухливості фосфоліпідних молекул у мембрані, фазового стану мембранних ліпідів. Відхилення біофізичних характеристик ліпідного бішару від норми пов'язане з різного роду патологіями. Важливу роль у фізіології клітини грають фазові переходи в біологічних мембранах.

Ліпідна фаза біологічних мембран при фізіологічних умовах (температурі, тиску, хімічному складі навколишнього середовища) знаходиться в рідкому агрегатному стані. Це доведено методами флюоресцентного аналізу (з використанням флюоресцентних зондів і міток), електронного парамагнітного резонансу (ЕПР), з використанням спінових зондів і міток, і ядерного магнітного резонансу (ЯМР).

У нормальному стані мембрана не флюоресціює. Щоб провести дослідження мембрани флюоресцентним методом, треба вводити в мембрану молекули або молекулярні групи, здатні до флюоресценції. У якості флюоресцентних зондів використовуються: ДМХ – диметиламінохалкон; МБА – 3-метоксібензантрон; АНС - І-анілін-нафталін-сульфонат і ін. (мал. 1.5).

Флюоресцентний аналіз дає можливість досліджувати рухливість фосфоліпідних молекул у мембрані, оцінити в'язкість ліпідної фази мембрани (так названу мікров'язкість мембран). Мікров'язкість мембрани можна оцінити по змінах спектрів флюоресценції, а також по ступені поляризації Ρ флюоресцентного випромінювання при висвітленні мембрани поляризованим світлом. Зв'язок ступеня поляризації Ρ і мікров'язкості мембрани η виражається формулою Перрена і Яблонського:

де P₀ - ступінь поляризації світла на нерухомих молекулах, R = 8,31 Дж/(К×моль) – універсальна газова стала, Т (К) – температура, V – молярний об’єм флюоресцюючих молекул, τ – час життя збудженого стану.

Найбільш повні відомості про агрегатний стан ліпідних бішарів дають методи радіоспектроскопії ЕПР і ЯМР.

Електронний парамагнітний резонанс – це явище різкого зростання поглинання енергії електромагнітної хвилі системою парамагнітних частинок (електронів з некомпенсованими спінами), поміщених у зовнішнє магнітне поле, при резонансній частоті хвилі ν_рез.

Резонансне значення частоти:

де В – індукція магнітного поля, h – постійна Планка, g –гідромагнітне відношення, або g – фактор, що залежить від природи парамагнітних частинок. Для вільного електрона g» 2. Магнетон Бора β = 0,927×10^-23 Дж/Тл. Практично зручніше залишати частоту ν електромагнітної хвилі постійною, а повільно змінювати індукцію магнітного поля В. Резонансне поглинання енергії буде спостерігатися при

У ЕПР використовуються частоти електромагнітного поля ν ~ 10¹⁰ Гц і індукція В~0,3 Тл. Спектром ЕПР називається залежність потужності поглинання Р електромагнітної хвилі від величини магнітної індукції В.

Чим сильніша взаємодія між атомами і молекулами зразка, тим спектри ЕПР ширші. Чим слабша взаємодія між частинками (більша рухливість молекул), тим уже спектри ЕПР (мал. 1.6). По ширині спектрів ЕПР можна судити про рухливість молекул речовини.

Тому що молекули фосфоліпідів діамагнітні, для ЕПР-досліджень біомембран використовуються спіни-зонди і мітка-мітки-спіни-мітки – молекули або молекулярні групи з неспареними електронами. Формула одного з таких сполук, часто використовуваного при епр-спектроскопії мембран, дана на мал. 1.7.

Парамагнітні спіни-зонди вводяться в ліпідну мембрану, спектри поглинання спінами-зондами електромагнітної хвилі подають інформацію про властивості ліпідного оточення, зокрема про рухливість ліпідних молекул у мембрані.

Незважаючи на коштовну інформацію, що удалося одержати при дослідженні біологічних об'єктів методом ЕПР із використанням спінових зондів, цей метод має істотний недолік – внесення в біологічний об'єкт чужорідних молекул-зондів може змінювати структуру об'єкта. Від цього недоліку вільний метод ЯМР.

Ядерний магнітний резонанс – це явище різкого зростання поглинання енергії електромагнітної хвилі системою атомних ядер, що володіють магнітним моментом, поміщених у зовнішнє магнітне поле, при резонансній частоті хвилі ν_рез:

де g_я - ядерний множник Ланде, що має різні значення для різних парамагнітних ядер, для протона g_я = 5,58; μ_я - ядерний магнетон складає 1/1836 частину магнетона Бора.

Магнітним моментом володіють, наприклад, такі ядра, як , , . Не мають магнітного моменту такі ядра, як , , . У біологічному об'єкті міститься багато ядер – протонів, що дає можливість застосовувати для їхнього дослідження ЯМР. У ЯМР використовуються більш сильні магнітні поля (У» 1Тл), а частоти змінного електромагнітного поля менші (5×10⁷ Гц), чим у ЕПР.

Як і у випадку ЕПР, спектри ЯМР тим ширші, чим більша в'язкість і менша молекулярна рухливість досліджуваного об'єкта.

Флюоресцентні, ЕПР- і ЯМР-дослідження показали, що рухливість фосфоліпідних молекул у мембрані порівняно велика, а в'язкість мала. У нормальних фізіологічних умовах ліпідна частина мембрани знаходиться в рідкому агрегатному стані. В'язкість ліпідної мембрани порівнянно з в'язкістю соняшникової олії:

η = (30 – 100) мПа × с,

(для порівняння: в'язкість води при 20°С складає 1 мПа × с).

Зміна мікров'язкості ліпідного оточення мембранних білків-ферментів різко позначається на їхньому функціонуванні. Деякі експериментальні дані свідчать про те, що канцерогенез зв'язаний зі зниженням в'язкості ліпідної фази мембрани, а при старінні в'язкість, навпаки, збільшується. Розробляються діагностичні методи, засновані на вимірювані мікров'язкості мембран за допомогою спін-зондів.

Цікаво, що мікров'язкість мембрани в кінців ліпідних хвостів менше, ніж біля полярних голів. Це доведено методом ЕПР із використанням спін-міток. Спінові мітки приєднувалися до різних місць фосфоліпідної молекули. Як видно з мал. 1.8, другому положенню спінової мітки відповідає більш вузький спектр ЕПР, а отже, рухливість ділянки 2 фосфоліпідної молекули більша, ніж ділянки 1. Тому в середині мембрани впорядкованість у взаємному розташуванні хвостів фосфоліпідних молекул менша.

Висока рухливість ліпідних молекул обумовлює латеральну (бічну) дифузію. Латеральна дифузія - це хаотичне теплове переміщення молекул ліпідів і білків у площині мембрани. При латеральній дифузії поруч розташовані молекули ліпідів стрибком міняються місцями і внаслідок таких послідовних перескоків з одного місця в інше молекула переміщається уздовж поверхні мембрани. Середнє квадратичне переміщення S_кв молекул при дифузії за час t

можна оцінити по формулі Ейнштейна:

Знаючи S_кв, можна знайти значення коефіцієнта латеральної дифузії D. Переміщення молекул по поверхні мембрани клітини за час t визначено експериментально методом флюоресцентних міток– флюоресціюючих молекулярних груп. Флюоресцентні мітки роблять флюоресціюючими молекули, рух яких по поверхні клітин7и можна вивчати, наприклад, досліджуючи під мікроскопом швидкість розпливання по поверхні клітини флюоресціюючої плями, створеної такими молекулами. Дотепний прийом, використовуваний з метою визначення швидкості переміщення флюоресціюючих молекул – фотознебарвлення. У клітину вводять молекули мічені флюоресцентними мітками, а потім невелика ділянка клітинної поверхні (кілька квадратних мікрометрів) опромінюють лазерним променем. Під дією лазерного випромінювання молекули втрачають здатність флуоресціювати. Вимірюючи швидкість відновлення флюоресценції в знебарвленій області по швидкості зменшення радіуса знебарвленої плями, одержують оцінку швидкості латеральної дифузії.

Виявилося, що середнє квадратичне переміщення за секунду фосфоліпідної молекули по поверхні мембрани еритроцита склало близько 5 мкм, що співмірно з розмірами клітин. Таким чином, за секунду молекула може пробігти усю поверхню невеликої клітини. Виявлене середнє квадратичне переміщення білкових молекул склало близько 0,2 мкм за секунду.

Розраховані по формулі Ейнштейна коефіцієнти латеральної дифузії для ліпідів D_лип» 6 × 10^-12 м²/с, для білків D_б» 10^-14 м²/c.

Частота перескоків (число перескоків у секунду) молекули з одного місця на інше внаслідок латеральної дифузії може бути знайдена по формулі:

,

де f - площа, зайнята одною молекулою на мембрані.

Для молекул фосфоліпідів D_лип = 6×10^-12 м²/с, f» 7×10^-19 м². Для цих значень частота перескоків ν = 3×l0⁷ с^-1. Кожна молекула, таким чином, у середньому перетерплює десятки мільйонів перестановок у площині мембрани за секунду, тобто характерний час одного перескоку τ = 10^-7 – 10^-8 с.

Фліп-флоп – це дифузія молекул мембранних фосфоліпідів поперек мембрани.

Швидкість перескоків молекул з однієї поверхні мембрани на іншу (фліп-флоп) визначена методом спінових міток у досвідах на модельних ліпідних мембранах – ліпосомах (див. § 5).

Частина фосфоліпідних молекул, з яких формувалися ліпосоми, помічувалася приєднаними до них спіновими мітками. Ліпосоми піддавалися впливові аскорбінової кислоти, унаслідок чого неспарені електрони на молекулах пропадали: парамагнітні молекули ставали діамагнітними, що можна було знайти по зменшенню площі під кривою спектра ЕПР.

Спочатку «нейтралізувалися» неспарені електрони молекул, розташованих на зовнішніх поверхнях ліпосом, що приводило до зменшення числа неспарених електронів у два рази. ЕПР потім визначався спінами-мітками на внутрішніх, не доступних дії аскорбінової кислоти поверхнях ліпосом. Однак площа під спектрами ЕПР продовжувала знижуватися, що свідчило про зменшення числа неспарених електронів. Це розумілося перескоками міченими спінами-мітками молекул із внутрішньої поверхні бішарової мембрани ліпосоми на зовнішню – фліп-флопом. По швидкості зменшення інтенсивності сигналу ЕПР установлено, що половина мічених молекул перетерплює фліп-флоп приблизно за 6,5 годин, оскільки приблизно через цей час площа під кривою спектра ЕПР (а отже, число неспарених електронів) зменшувалося в два рази.

Таким чином, перескоки молекул з однієї поверхні бішару на іншу (фліп-флоп) відбуваються значно повільніше, ніж перескоки при латеральній дифузії. Середній час, через яке фосфоліпідна молекула робить фліп-флоп (Т (1 годину), у десятки мільярдів раз більше середнього часу, характерного для перескоку молекули з одного місця в сусіднє в площині мембрани.

Сполучення швидкої дифузії молекул уздовж мембрани і дуже повільної дифузії впоперек мембрани має велике значення для функціонування мембран, а саме для матричної функції мембрани (див. § 1). Завдяки утрудненому переходові впоперек мембрани підтримується впорядкованість у молекулярній структурі мембрани, її анізотропія, асиметрія (щодо площини мембрани) розташування ліпідних і білкових молекул, визначена орієнтація білків-ферментів впоперек мембрани. Це має велике значення, наприклад, для спрямованого переносу речовин через мембрану.