Механізм дії ферментів

Механізм ферментативного каталізу є об’єктом дослідження багатьох учених. При ферментативному каталізі виявляється білкова природа ферментів, їх термолабільність, вплив рН середовища, специфічність дії, висока каталітична здатність, чутливість до активаторів і інгібіторів. Ферментативна реакція протікає згідно закону дії мас.

Ферменти і енергія активації. Ферменти – це біологічні каталізатори. Вони впливають на швидкість реакцій в двох напрямах: прискорюють розщеплення або синтез певних речовин. Збільшення швидкості реакції відбувається внаслідок зміни енергії активації молекул субстратів. Енергія активації E характеризує енергетичний бар’єр, який необхідно подолати, щоб привести реагуючі речовини в активний стан. Він обумовлений силами міжмолекулярного зчеплення або міжмолекулярного відштовхування реагуючих речовин. Швидкість реакції можна збільшити, якщо збільшити число молекул, що активуються, або зменшити висоту енергетичного бар’єру. Молекули субстратів можна привести в активний стан різними прийомами. Одним з них є нагрівання, при якому в розчинах зростає швидкість руху молекул і можливість їх зіткнення. За наявності каталізатора знижується енергетичний бар’єр і енергія активації. Так, для розщеплення сахарози на глюкозу і фруктозу під впливом сірчаної кислоти E= 134400 Дж/моль, а за участю інвертази – 40420 Дж/моль. Для гідролізу казеїну соляною кислотою E =109200 Дж/моль, пепсином – 50400 Дж/моль. Енергія активації розкладання Н₂О₂ без каталізатора рівна 75600 Дж/моль, з участю колоїдної платини – 49140, каталази печінки – 23100 Дж/моль.

Теорія ферментативного каталізу. Існуючі теорії, пояснюючи взаємодію ферменту і субстрата, допускають тимчасове їх з’єднання з утворенням проміжного фермент-субстратного комплексу. Теорія ферментативного каталізу (теорія Міхаеліса – Ментен) припускає такі етапи:

I етап. Між субстратом і ферментом виникає зв’язок, внаслідок чого утворюється фермент-субстратний комплекс ES, в якому компоненти зв’язані між собою ковалентним, іонним, водневим та іншими зв’язками.

II етап. Субстрат під впливом приєднаного ферменту активується, стаючи доступним для відповідних реакцій каталізу ES.

III етап. Здійснюється каталіз ES*.

IV етап. Вивільнюється молекула ферменту E і продукти реакції P.

Послідовність перетворень відображає схема:

Теорія ферментативного каталізу була підтверджена експериментально. Так, з хріну був виділений фермент, що розщеплює пероксид водню – пероксидаза коричневого кольору. Після з’єднання ферменту Е з субстратом Н₂O₂ (S) виникає фермент-субстратний комплекс ES зеленого кольору. Через деякий час субстрат активується, утворюючи фермент-активований субстрат ES* червонуватого кольору. Він розщеплюється на коричневий фермент E і продукти розпаду P.

Б. Чанс розробив чутливі методи для спектрофотометричного вивчення кінетики ферментативних реакцій на всіх етапах каталізу.

Кінетика ферментативних реакцій. Кожна хімічна реакція протікає з певною швидкістю. Біологічне призначення ферментів полягає в направленому підвищенні швидкості хімічних реакцій.

Ферментативна кінетика – розділ хімічної кінетики, що вивчає залежність швидкостей ферментативних реакцій від хімічної природи реагуючих речовин (субстратів, ферментів) і умов їх взаємодії (концентрації компонентів, рН, складу середовища, температури, дії активаторів або інгібіторів та ін.).

Розрізняють декілька типів ферментативних реакції: необоротні реакції з одним субстратом, оборотні реакції з одним субстратом, необоротні реакції з двома субстратами і т.д. Найбільш поширені необоротні реакції з одним субстратом.

Згідно теорії ферментативного каталізу (Л. Міхаеліс і M. Ментен; Дж. Бріггс і Дж. Холдейн), фермент E спочатку реагує з субстратом S, що призводить до утворення фермент-субстратного комплексу ES (в багатьох реакціях – двох і більше комплексів, що виникають в певній послідовності). Фермент-субстратний комплекс характеризується константою швидкості реакції його утворення k₊₁ і константою швидкості реакції розпаду k_–1:

Для характеристики утворення фермент-субстратного комплексу була прийнята субстратна константа, або константа дисоціації Кs, яка рівна:

Величина субстратної константи залежить від природи субстрату і ферменту. При однакових початкових концентраціях ферменту і субстрату концентрація комплексу [ES] буде тим більша, чим менша величина Кs:

Субстратна константа визначає ступінь спорідненості ферменту і субстрату. Так, для інвертази, яка здійснює гідролітичне розщеплення сахарози до глюкози і фруктози, K_S= 0,0167. Тут концентрація фермент-субстратного комплексу перевищує концентрацію вільних ферменту і субстрата приблизно в 60 разів.

У другій фазі ферментативного каталізу фермент-субстратний комплекс розпадається на фермент E і продукт реакції P. Обидві фази ферментативного каталізу з’єднано в систему, типову для необоротних реакцій з одним субстратом:

В системі k₊₂ означає константу швидкості розпаду фермент-субстратного комплексу на фермент Е і продукт реакції P.

Для повної характеристики ферментативного процесу використовується константа Міхаеліса Кm. Вона виражає відношення констант трьох реакцій, показаних в системі:

Числовий вираз Кm завжди дещо більше, ніж Ks. Так, значення Кs для фермент-субстратного комплексу сахараза – сахароза рівно 0,0167, а величина Кm – 0,0280 моль/л. Кm для різних ферментів неоднакова.

Швидкість хімічної реакції, що каталізується ферментом, вимірюється кількістю молів субстрата, які перетворюються за одиницю часу. Так, швидкість ферментативної реакції, що протікає за оптимальних умов (повне насичення ферменту субстратом, температура 25°С або 37°C, рН), позначається символом V і називається максимальною, або початковою, швидкістю. Вона визначається константою швидкості розпаду фермент-субстратного комплексу і концентрацією ферменту:

Для ферментативної реакції, яка протікає при недостатньому насиченні ферменту субстратом, характерна спостережувана швидкість . Вона визначається добутком константи швидкості розпаду фермент-субстратного комплексу з утворенням продукту реакції Р і концентрації фермент-субстратного комплексу [ES]:

Якщо врахувати, що

,

і

,

то

Таким чином, швидкість ферментативної реакції прямо пропорційна константі швидкості розпаду фермент-субстратного комплексу з утворенням продукту реакції, концентраціям ферменту, субстрату і обернено пропорційна субстратній константі.

Для стаціонарної стадії реакції концентрація [ES] постійна. Якщо [S] > [Е],то

Застосовуючи константу Міхаеліса, можна спростити рівняння:

Спостережувану швидкість реакції можна виразити рівнянням:

При збільшенні концентрації субстрату [S], коли [S] > Km

Тут швидкість ферментативної реакції прагне до максимальної швидкості. Швидкість реакції можна охарактеризувати рівнянням Міхаеліса – Ментен:

З рівняння витікає, що при незначній концентрації субстрату швидкість ферментативної реакції лінійно залежить від [S], а при дуже високій концентрації субстрату вона прагне максимальної швидкості Vmax і вже не змінюється із збільшенням [S]. Рівняння також показує, що при збереженні рівня [S] > [E] швидкість реакції пропорційна концентрації ферменту E.