Этапы ферментативного секвенирования

1. Получение исследуемой ДНК. В качестве исследуемой ДНК могут выступать:

a. геномная ДНК, выделенная непосредственно из клеток и вирусов (из-за больших размеров геномной ДНК секвенировать ее трудно, и потому ее предварительно нарезают на фрагменты с перекрывающимися концами при помощи ферментов рестрикции, после чего секвенируют, результаты суммируют);

b. плазмидная ДНК;

c. фрагменты ПЦР-ДНК, которые получают в процессе ПЦР и очищают от ингибиторов секвенирования;

d. ДНК, полученное путем обратной транскрипции на вирусной РНК.

2. Постановка сиквенс-ПЦР. Реакцию ставят в обычном ПЦР-амплификаторе используя аналогичные для ПЦР температурные режимы. В реакции участвую следующие ингредиенты: 1) одноцепочечный фрагмент ДНК, последовательность которого необходимо определить; 2) праймер (затравочная молекула, комплементарная участку изучаемой ДНК; 3) секвеназа (особая ДНК – полимераза); 4) дезоксинуклеотидтрифосфаты (дГТФ, дАТФ, дЦТФ, дТТФ); 5) дидезоксинуклеотидтрифосфаты (ддГТФ, ддАТФ, ддЦТФ, ддТТФ), меченые флюорофором; 6) реакционный буфер.

3. Проведение секвенирующего электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле. Позволяет разделить фрагменты, различающиеся размером в один нуклеотид.