Методы культивирования вирусов. Методы индикации вирусов при различных способах культивирования. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций

Определение вирусов как особых форм организации живого. Принципы классификации и таксономии вирусов. Морфология и структура вирусов. Понятие о вирионе. Типы симметрии нуклеокапсида. Химический состав вирусов.

Основные свойства вирусов. Нет клеточной структуры. Не имеют обмена веществ, нет питания и дыхания, нет ферментных и белоксинтезирующих систем. Являются облигатными внутриклеточными паразитами.

Критерии живой природы вирусов. Способны к размножению, обладают наследственностью, способны изменчивости. Морфология и структура вирусов, роль отдельных компонентов вириона. Вирусы устроены примитивно просто. В состав любого вируса входит нуклеиновая кислота (НК) и белковая оболочка. В состав вируса входит только один тип НК – либо ДНК, либо РНК. НК – это геном вируса. Белковая оболочка вируса называется капсид. Капсид образуют отдельные белковые молекулы – капсомеры. У просто устроенных вирусов больше ничего нет. Сложные вирусы имеют суперкапсид – наружную оболочку. Суперкапсид по химической структуре состоит их липопротеидов, липидов, полисахаридов. Суперкапсид чаще всего имеет клеточное происхождение. В состав вириона могут также входить ферменты – ДНК-полимераза, обратная транскриптаза. Функции НК вируса.

1. Сохранение и передача наследственной информации.

2.Инфекционные свойства вируса обусловлены также НК, именно НК проникает в клетку и заставляет клетку синтезировать новые вирусные частицы, клетка в конечном итоге погибает. Функции оболочки.

1.Определяет форму вируса. Форма вируса зависит от типа симметрии.

Существует три типа симметрии вирусов: кубический, спиральный, смешанный. Тип симметрии определяется расположением капсомеров в капсиде. При кубическом типе симметрии капсомеры располагаются так, что образуют геометрическую фигуру – многогранник (напр.икосаэдр), в этом случае в вирусной частице есть полость, в которой располагается НК. Такие вирусы под электронным микроскопом обычно имеют шаровидную форму. При спиральном типе симметрии капсомеры располагаются по спирали, повторяя ход спирали НК. В этом случае полости внутри вируса нет, капсомеры плотно прилегают к НК. Такие вирусы имеют обычно палочковидную, цилиндрическую, нитевидную форму. При смешанном типе смметрии в составе вируса есть части и со спиральным, и с кубическим типом симметрии, напр., бактериофаги.

2.Адресная функция оболочки. На поверхности оболочки вируса есть рецепторы, соответствующие рецепторы есть на поверхности клетки, взаимодействие этих рецепторов приводит к адсорбции вируса на клетке. Адсорбция – это всегда процесс специфического взаимодействия рецепторов. Поэтому вирус может проникнуть не в любую клетку, а только в ту, к которой у него есть рецепторы. Свойство вирусов специфически взаимодействовать только с определенными клетками наз. тропизмом вирусов. Все вирусы обладают тропизмом к определенным клеткам и тканям. 3. Антигенные свойства. Оболочки вируса являются носителями антигенных свойств вируса. 4. Защитная функция. Оболочки вируса защищают вирион внутри организма от действия нуклеаз. 5. Первичная токсичность вируса.

Классификация вирусов. При классификации вирусов учитываются

следующие свойства.

1. тип и характеристика нуклеиновой кислоты

2.морфология и строение вириона

3.размеры вириона

4. наличие оболочек вируса

5. антигенная структура

6. внутриядерная или цитоплазматическая локализация

7. резистентность к температуре, РН среды, эфиру

8. тропизм к тканям

9. способность образовывать тельца включений

Царство Vira

Подцарства РНК и ДНК-вирусы

Семейства(13 РНК –содержащих и 6 ДНК-содержащих)

Подсемейства

Роды

Виды

2. Размножение вирусов. Основные стадии взаимодействия вирусов с клеткой хозяина при продуктивном типе инфекции. Особенности репродукции ДНК- и РНК- содержащих вирусов. Типы взаимодействия вируса с клеткой:автономный и интегративный.

Типы взаимодействия вирусов с клеткой.

• Автономный тип взаимодействия

• 1.Продуктивная инфекция

• 2. Абортивное инфекция

• Интегративный тип взаимодействия

Продуктивная инф. - заканчивается гибелью клеток и образованием популяции новых вирусных частиц. На фоне продуктивного взаимодействия вируса с клеткой возникает обычно острая вирусная инфекция. Абортивная инф. - не приводит к появлению вирусной популяции и гибели клеток хозяина. Интегративное взаимодействие - нуклеиновая кислота вируса встраивается в геном клетки и сосуществует с клеткой длительное время. Такой вирус называется провирус, явление перехода вируса в форму провируса наз. вирогенией, а клетка, содержащая вирус в форме провируса - вирогенная клетка. На фоне интегративного взаимодействия вируса с клеткой возникает персистентная вирусная инфекция. Она может проявляться тремя типами инфекций: латентная вирусная инфекция, хроническая вирусная инфекция, медленная вирусная инфекция.

Этапы вирусной репродукции при продуктивной вирусной инфекции.

• 1. адсорбция вирусов

• 2. проникновение вирусов в клетку путем рецепторного эндоцитоза

• 3. синтез ранних вирусных белков (ферменты репликации и синтеза

структурных белков вируса)

• 3. репликация вирусной нуклеиновой кислоты и синтез поздних

вирусных белков

• 4. сборка вирусов

5. выход вирусов из клетки.

Методы культивирования вирусов. Методы индикации вирусов при различных способах культивирования. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Методы культивирования вирусов.

Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты, поэтому они не растут на питательных средах. Для их культивирования нужна живая клетка. Существует три модели для культивирования вирусов: куриный эмбрион, организм чувствительного лабораторного животного, культура клеток. Культура клеток – это клетки многоклеточного организма, выращенные в пробирке. Разновидности культур клеток: 1. первично- трипсинизированные 2. полуперевиваемые 3.Перевиваемые.

Индикация вирусов при разных методах культивирования.

1. Заражение восприимчивых лабораторных животных: гибель

животного, проявление клинических симптомов, обнаружение телец

включений

2. Заражение куриных эмбрионов(4-12 дневных): гибель эмбриона,появление бляшек на хорион-аллантоисной оболочке, реакциягемагглютинации с аллантоисной жидкостью.

3. Заражение культур клеток: цитопатическое действие (ЦПД), бляшкообразование, тельца включений, реакция гемагглютинации скультуральной жидкостью, реакция гемадсорбции,цветная реакция.

Реакции гемагглютинации и гемадсорбции вирусов, их механизм. Многие вирусы имеют рецептор гемагглютинин, который вызывает агглютинацию различных эритроцитов – куриных, эритроцитов лягушки, бараньих, человеческих и др. Такой способностью обладают многие вирусы, т.е. реакция гемагглютинации неспецифическая, идентифицировать вирус по ней нельзя, а обнаружить можно. Реакция проста в постановке: на стекле к капле взвеси эритроцитов добавляют каплю культуральной или аллантоисной жидкости, и наблюдают агглютинацию эритроцитов. Феномен гемадсорбции – это способность вирусов адсорбироваться на клетках культуры ткани, содержащих вирус. В основе этой реакции также лежит действие рецептора гемагглютинина. Эта реакция используется тогда, когда вирус не вызывает ЦПД и длительно не покидает клетки.

Методы идентификации вирусов.

Вирусы идентфицируются по антигенной структуре в реакциях торможения гемагглютинации (РТГА), торможения гемадсорбции (РТГАдс.), нейтрализации (РН), связывания комплемента (РСК). Для дентификации вирусов по антигенной структуре необходимы диагностические сыворотки, содержащие антитела к антигенам вирусов.

Методы диагностики вирусных инфекций.

1. Вирусоскопический метод диагностики – обнаружение вирусов путем световой или электронной микроскопии; обнаружение телец включений в клетках, пораженных вирусами.

2. Вирусологический метод диагностики – выделение и идентификация вирусов. Этапы: а) накопление вирусов при культивировании их на одной из моделей; б) индикация и титрование вирусов; в) идентификация вирусов.

3. Биологический метод диагностики - заражение восприимчивых лабораторных животных с целью получения типичной клинической картины заболевания.

Иммунологические методы

1. Собственно-имунный метод–выявляют вирусные антигены в патологическом материале с помощью ИФА, ИФ, ИП, имунный электрофорез и т.д.

2. Серологический метод – определение наличие антител, их титр или динамику нарастания титра с помощью РСК, РТГА, РН, ИФА.

3. Генетический метод – ПЦР, поиск и идентификация вирусной НК в патологическом материале.

4. Поксвирусы:вирусы натуральной оспы и осповакцины.

Поксвирусы. Среди вирусов этого семейства наиболее значимымявляется вирус натуральной оспы, возбудитель грозных пандемий. Это самые крупные и самые высокоорганизованные вирусы среди всех известных вирусов животных. Имеют форму кирпича с закругленными углами, размер 250-450нм, геном в виде двунитевой линейной ДНК, белковый капсид. По обе стороны от сердцевины вируса имеются два белковых тела. Имеется наружняя липидная оболочка с трубчатыми белковыми структурами. Вирус имеет химический состав, напоминающий бактериальный: он содержит нейтральные жиры, углеводы, фосфолипиды. Поксвирусы, единственные из ДНК- содержащих вирусов размножается в цитоплазме клеток. Вирусы культивируются в культуре клеток, где вызывают круглоклеточковую дегенерацию(цитопатическое действие); в курином эмбрионе на хорионалантоисной оболочке, на которой образуются белые бляшки.

Эпидемиология и патогенез. Источник инфекции – больной человек. Вирус передается воздушно-капельным и контактным путем(черезполотенца, постель, предметы обихода). Вирус размножается в лимфоидной ткани глоточного кольца, затем вирус проникает в кровь, возникает вирусемия откуда вирус проникает в эпидермис, вызываяпролиферацию шиповидных клеток и дегенерацию клеток мальпигиевого слоя. Инкубация составляет в среднем две недели. Болезнь начинается остро с головными болями, миалгиями лихорадкой. На коже появляется сыпь в стадии макулы, папулы, пузырьков и пустул, затем появляется корочка, которая отпадает, после чего остается рубец. Течение инфекции тяжелое, летальность может достигать 40%. После перенесенного заболевания иммунитет сохраняется пожизненно.

Лабораторная диагностика проводится вирусоскопическим методом с использованием электронной и световой микроскопии. При световой микроскопии в препаратах и пустул обнаруживаются клетки с тельцами Гварниери. В препаратах из содержимого оспенных пузырьков при окраске по Морозову выявляются тельца Пашена. При серологическом методе обнаруживают комплементсвязывающие антитела уже после первой недели заболевания. Специфический антиген вируса оспы может быть обнаружен из элементов сыпи с помощью ИФА или РИФ.При вирусологическом методе диагностики материалом больного (кровь, отделяемое носоглотки? элементы сыпи, секционный материал) заражают хорион-алантоисную оболочку куриных эмбрионов.

Специфическая профилактика осуществляется осповакциной, которая содержит живой вирус осповакцины. Предполагают что вирус осповакцины произошел от вируса коровьей оспы или натуральной оспы и адаптировался к человеку. Впервые этот вирус для профилактики оспы применил Дженер В 1796году. Благодаря широкомасштабным профилактическим мероприятиям во всем мире проводимым ВОЗ с 1967года по 1980год натуральная оспа полностью ликвидирована.

5. Характеристика биологических свойств, патоггенез герпесвируснойя инфекции.Онкогенные функции генома герпеса. Спецефическая профилактика.

Семейство герпесвирусов включает 72 вируса, из них для человека патогенны 8 типов: вирусы простого герпеса 1 и 2 типов, вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая, цитомегаловирусы, вирус Эпштейна-Барр,

лимфотропные вирусы 6, 7 и 8 типов. Все они отличаются друг от друга по антигенным свойствам. Это крупные вирусы 150-210 нм. Геном представлен двунитевой линейной ДНК, покрытой капсидной оболочкой в форме икосаэдра. Имеют суперкапсидную оболочку. Термолабильны, чувствительны к УФЛ. Это самые распространенные и неконтролируемые вирусы. Проникают в организм человека разнообразными путями: воздушно-капельным, контактно-бытовым, трансплацентарным, трансфузионным, половым. Чаще поражает кожу и слизистые, вызывает тяжелые поражения глаз, гениталий и ЦНС.

Герпес вирусы при электронной микроскопии. Вирус простого герпеса инфицирует организм человека в раннем

возрасте. У 80% людей имеет бессимптомное течение. У остальных протекает в виде стоматита, кератита, менингоэнцефалита, генитального герпеса, герпеса новорожденных. Вирус сохраняется в ганглиях тройничного(1тип) и крестцовых нервов (2тип) на протяжении всей жизни человека, периодически вызывая обострения, которые могут быть спровоцированы лихорадкой, УФЛ, стрессами и т.д.)

Вирус ветряной оспы вызывает у детей ветряную оспу. У некоторых взрослых людей перенесших ветряную оспу в детстве, вызывает опоясывающий лишай. Это происходит у лиц со сниженной иммунобиологической реактивностью. При этом везикулярные высыпания появляются по ходу чувствительных волокон периферических нервов, чаще односторонние.

Цитомегаловирус поражает практически все внутренние органы, в клетках которых появляются внутриядерные включения. Особо опасен вирус для беременных, так как способен вызывать внутриутробную инфекцию плода с развитием тяжелых уродств.

Вирус Эпштейна-Барр вызывает инфекционный мононуклеоз, лимфому Беркита(опухоль верхней челюсти) в центральной Африке, назофаренгиальную карциному у мужчин в Китае. Этот вирус вызывает пролиферацию лимфоцитов.

Вирус 6 типа вызывает внезапную экзантему у детей раннего возраста и синдром хронической усталости у взрослых людей.

Вирус 7 типа вызывает лимфопролиферативные заболевания и синдром хронической усталости.

Вирус 8 типа вызывает саркому Капоши, чаще всего у больныхСПИДом.

Лабораторная диагностика герпетических инфекций осуществляется вирусоскопическими, серологическими методами, а также ПЦР. Для специфической профилактики простого герпеса тспользуют живые, аттенуированные вакцины, убитые и субъединичные вакцины.

6. Аденовирусы.

Аденовирусы человека относятся к семейству Adenoviridae, принадлежат к роду Mastadenovirus, и подразделяются на подроды А, В, С, D, Е и F. В настоящее время известно не менее 49 серотипов аденовирусов

человека. Биологические особенности аденовирусов. В семейство объединены вирусы с голым капсидом (отсутствует внешняя оболочка), кубическим типом симметрии. Размер вириона 60–90 нм. Геном

представлен линейной молекулой двухнитевой ДНК.

Зрелый вирус состоит из 252 капсомеров, включающих в себя: 1) гексоны, содержащие типоспецифические антигенные детерминанты, действующие при высвобождении гексонов в составе вириона, ответственные за проявление токсического эффекта;

2) пентоны, содержащие малые антигены вируса и реактивный растворимый антиген семейства, обуславливающие гемагглютинирующие свойства вирусов.

Антигенная структура:

1) поверхностные антигены структурных белков (видо– и типоспецифичные);

2) антигены гексонов (группоспецифичные);

3) комплементсвязывающий антиген (идентичный для различных серотипов).

Основные пути передачи – воздушно-капельный и контактный.

Симптоматика поражений обусловлена репродукцией возбудителя в чувствительных тканях. По типу поражений чувствительных клеток выделяют три типа инфекций:

1) продуктивную (литическую) - cопровождается гибелью клетки после выхода дочерней популяции;

2) персистирующую - наблюдается при замедлении скорости репродукции, что дает возможность тканям восполнять потерю инфицированных клеток за счет нормального деления неинфицированных клеток;

3) трансформирующую - в культуре ткани происходит превращение клеток в опухолевые.

Основные клинические проявления аденовирусных инфекций

1. Наиболее часто – ОРВИ, протекающие по типу гриппоподобных поражений. Пик заболеваемости приходится на холодное время года. Вспышки возможны в течение всего года.

2. Фарингоконъюнктивиты (фарингоконъюнктивальная лихорадка). Пик заболеваемости приходится на летние месяцы; основной источник инфекции – вода бассейнов и природных водоемов.

3. Эпидемический кератоконъюнктивит. Поражения обусловлены инфицированием роговицы при травмах либо проведении медицинских манипуляций. Возможны эрозии роговицы вплоть до потери зрения.

4. Инфекции нижних отделов дыхательных путей.

Лабораторная диагностика

1) Выделение возбудителя инокуляцией в культуры эпителиальных клеток человека; исследуемый материал – отделяемое носа, зева, конъюнктивы, фекалии.

2) Выявление антигенов вирусов в клетках иммунофлюоресцентной микроскопией.

3) РСК, РТГА и РН цитопатического эффекта в культуре клеток.

Лечение: средства специфической лекарственной терапии отсутствуют.

Специфическая профилактика: живые вакцины, включающие в себя ослабленные вирусы доминирующих серотипов.