Фотометрические методы определения мочевины

Фотометрическиеметоды определения мочевиныоснованы на реакциимочевиныс различными веществами с образованием окрашенных соединений.

Среди фотометрических методов определения мочевины наиболее распространенными являются методы, основанные на реакции мочевины с диацетилмонооксимом (диацетилмонооксимная реакция, реакция Ферона), протекающей в два этапа.

На первом этапе диацетилмонооксим расщепляется до диацетила и гидроксиламина. На втором этапе диацетил в кислой среде вступает в реакцию конденсации с мочевиной с образованием окрашенного комплекса. Величину его поглощения регистрируют при 550 нм, либо по его способности к флюоресценции при 415 нм.

Изменению окраски и стабилизации комплекса способствует использование ряда соединений или удаление из реакции образующегося при гидролизе гидроксиламина. Для окисления гидроксиламина могут применяться следующие вещества: персульфат калия, мышьяковая кислота, хлорная кислота, катионы, феназон. Для интенсификации окраски и повышения ее стабильности применяются: тиосемикарбазид, фенилантраниловая кислота, глюкуронолактон, катионы, триптофан и нитриты.

Диацетилмонооксимную реакцию адаптировали для определения мочевины в моче и сыворотке крови. Основной недостаток этого метода — светочувствительность комплекса и быстрое снижение его окраски. Другим недостатком является токсичность реактивов для проведения данной реакции.

Однако, несмотря на имеющиеся недостатки, методы этой группы отличаются хорошей воспроизводимостью, высокой чувствительностью, большой специфичностью. В некоторых методах используется 20 — 50 мкл сыворотки, что позволяет применять их без депротеинизации сыворотки.

Диацетилмонооксимный метод определения мочевины утвержден в качестве унифицированного.

Литература:

· Слепышева В. В., Балябина М. Д., Козлов А. В. - Методы определения мочевины

· Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под редакцией Меньшикова В. В. - Москва, "Медицина", 1987 г.

Ферментативные (уреазные) методы определения мочевины

Ферментативныеметоды определения мочевиныприобрели наибольшее распространение в современной клинико-лабораторной практике. Эти методы определениямочевиныназываются также уреазными, так как в них в качестве реактива используется фермент уреаза. Для уреазы мочевина является единственным физиологическим субстратом, поэтому уреазные методы высокоспецифичны.

При сборе материала для исследования следует помнить, что фторид ингибирует уреазную реакцию. В связи с этим методы, основанные на использовании уреазы, не могут использовать образцы крови с добавлением фторида. Кроме того, для уреазных методов не может использоваться в качестве антикоагулянта аммониевая соль гепарина.

Ферментативные методы определения мочевины достаточно многочисленны, но все состоят из двух этапов. Первый этап - общий для всех уреазных методов. Суть его заключается в том, что под действием уреазы происходит гидролиз мочевины до аммиака. На втором этапе определяется концентрация аммиака, образовавшегося на первом этапе. В зависимости от используемых способов регистрации концентрации аммиака, ферментативные (уреазные) методы определения мочевины можно разделить на следующие группы:

· колориметрические по конечной точке,

· методы с использованием сопряженных ферментативных реакций,

· потенциометрические,

· методы с использованием технологии «сухой химии».