Трансгеноз животных

Термин «трансгеноз» возник в начале 70-х годов, значительно ранее того момента, когда он стал использоваться в современном значении этого слова. Первоначально им обозначали перенос генов в клетки, расту­щие в культуре, т.е. in vitro. В настоящее время этот термин используют применительно к переносу генов в целые организмы (систе­ма in vivo), а сами такие генетически измененные организмы называют трансгенными.

В 1980 г. Гордон с помощью микроинъекций "голой" ДНК в мужской пронуклеус зи­готы мыши получил первых животных, содержавших в своем гено­ме искусственно введенную экзогенную ДНК. Такие животные в дальнейшем и были названы трансгенны­ми, а сам процесс их получения - трансгенозом. Первоначальный вариант трансгеноза, использованный Гордоном, сейчас называют классическим (рис. 5).

С развитием техники молекулярного клонирования генов число публи­каций по получению и исследованию трансгенных мышей стремительно росло, постепенно расширялся спектр проблем и задач, решаемых с помо­щью трансгеноза. Одной из самых впечатляющих работ на ранних этапах развития трансгеноза были эксперименты Пальмитера с соавт. (1982) по микроинъекции в зиготы мышей гена гормона роста кры­сы, находящегося под контролем сильного промотора гена металлотиенина мыши МТ-1 мыши. Перенос такого искусственного конструкта привел к ускоренному росту мышей и значительному увеличению веса трансформированных животных, развившихся из прооперированных зигот (рис. 6).

Рисунок 5 - Классическая схема трансгеноза [3]

Вскоре анализу экспрессии в организме мышей были под­вергнуты сотни структурных генов, генов различных вирусов, онкогенов, антионкогенов и др. К середине 80-х годов были начаты эксперименты по созданию транс­генных сельскохозяйственных (с/х) животных. К этому времени были подо­браны оптимальные условия для визуализации пронуклеусов зигот с/х жи­вотных, поскольку большинство зигот имеет значительное количество пиг­ментных и жировых гранул, затрудняющих процесс микроинъекции.

Попытки переноса гена гормона роста быка, овец, человека, гена рилизинг-фактора гормона роста человека (выход гормона роста в кровь находился под конт­ролем эндогенных регуляторов) в дальнейшем были продолжены на зиготах овец, свиней, кроликов и рыбах как в нашей стране, так и за рубежом.

Рисунок 6 - Трансгенная мышь с геном гормона роста быка (слева) и контрольная [3]

Трансгеноз открыл новые пути направленного изменения продуктивно­сти разных видов с/х животных (повышение темпов роста, изменение коли­чества и качества молока, шерсти, увеличение плодовитости), получения животных - биореакторов ценных биологически активных препаратов (таких как фактор свертываемости крови, альфа-антитрипсин, гемоглобин и антитела в молоке, крови или моче), создание новых форм и пород животных, приспо­собленных к биомедицинским исследованиям, которые могут быть источни­ками органов для ксенотрансплантации, пород, устойчивых к различным за­болеваниям. В частности, с успехом для направленной экспрессии фармакологически ценных белков используются гены, кодирующие основные белки молока - казеины.

В России, например, в 1999 г. были получены трансгенные мыши, экспрессирующие в молоко ценный медицинский препарат - гамма-интерферон человека (600 мкг гамма-интерферона на 1 мл молока). Соответствующая генетическая конструкция может быть использована для получения трансгенных коз, в молоке которых будет экспрессироваться лекарствен­ный белок.

Вместе с тем с самого начала работ по трансгенозу были выявлены не­которые сложности, связанные с этой технологией. В первую очередь проце­дура получения трансгенных животных пока еще остается малоэффектив­ной. Трансгенные животные часто менее жизнеспособны, чем природные особи. Имеются проблемы и со стабильностью экспрессии трансгена. Все это, а также ряд других причин, включая настороженное отношение обще­ственности к данной проблеме, и обусловили ту ситуацию, что до сих пор трансгенные животные (в отличие от трансгенных растений) находят пока лишь ограниченное применение в практике.

Кроме традиционного (классического) способа введения чужеродной ДНК с помощью микроинъекций в пронуклеус зиготы, получили развитие новые системы и способы пере­носа генов в геном животных (рис. 64). Они позволяют повысить эффективность трансгеноза, что особенно важно для дорогостоящих экспериментов в области биотехнологии с/х жи­вотных. Показано, например, что эффективность получения с помощью ми­кроинъекций трансгенных коров, по меньшей мере, в 40 раз ниже, чем у мы­шей.

Одним из таких альтернативных подходов является использование спер­матозоидов в качестве векторов для привнесения чужеродной ДНК в яйце­клетку при ее искусственном оплодотворении. Известно, что сперматозоиды ряда видов животных в отсутствие семенной жидкости способны захватывать чу­жеродную ДНК. Легкость и простота использования этого метода привели к многочисленным попыткам трансформировать таким образом геном мы­шей, свиней, крупного рогатого скота, овец, рыб, морского ежа, насекомых, птиц, шпорцевой лягушки, моллюсков.

Необходимо отме­тить, однако, что существует опасность непреднамеренного введения экзо­генного генетического материала, который может случайно находиться в окружающей среде, при использовании метода внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидов (ICSI) в клиниках по искусственному оплодотво­рению человека. Показано также, что отмывка спермато­зоидов человека после инкубации в растворе с ДНК вируса папилломы че­ловека не приводила к полному удалению экзогенной ДНК из клеток. Часть ДНК прочно связывалось со сперматозоидами и интернализовалась вместе с ними.

Еще одним подходом, обеспечивающим увеличение эффективности переноса генов, является использование в качестве векторов ретровирусов. Основное преимущество этих векторов заключается в том, что они способ­ны эффективно инфицировать большое число различных клеточных типов. Чтобы избежать опасности неконтролируемого распространения ретровирусов, используют дефектные по репликации вирусные векторы с вирусом- помощником.

Ретровирусные векторы обеспечивают интеграцию единичной копии трансгена в эмбрионы на разных стадиях развития. Однако успешная интеграция вирусного генома с хозяйским гено­мом происходит только в митотически активных клетках (исключение со­ставляют лентивирусы). Показано, что для транслокации ретровируса в ядро клетки обязателен разрыв ядерной оболочки. Основываясь на этом, Чан с соавт. в 1998 г. предложили новый метод введе­ния ретровирусного вектора в геном крупного рогатого скота, который за­ключался в следующем. Ооциты, находящиеся на стадии метафазы II второ­го деления мейоза и не имеющие ядерной оболочки на этой стадии вплоть до образования пронуклеусов после оплодотворения, инфицировали ретро-вирусным вектором, сконструированным на основе вируса мышиной лейкемии Молони (MoMLTV), упакованного в оболочку, в состав которой входил гликопротеин псевдотипа вируса вези­кулярного стоматита G. В результате оплодотворения инфицированных ооцитов и их культивирования in vitro часть из них развилось до стадии бластоцисты. После переноса бластоцист реципиентам 4 эмбриона развились до рождения. И хотя количество животных, полученных таким путем, было ограниченным, все они (100%) оказались трансгенными и экспрессировали трансген.

Сообщалось о рождении трансгенной обезьяны, полученной аналогичным путем. Указанный вектор, содержащий в своем составе ген, кодирующий зеленый флуоресцентный бе­лок (GFP) под промотором гена альфа-1-фактора элонгации человека, был инъ­ецирован под блестящую оболочку ооцитов макак резусов. Опло­дотворение проводили методом ICSI. Эмбрионы на стадии дробления пере­саживали суррогатным самкам. 3 эмбриона развивались до рождения, один из новорожденных оказался трансгенным и экспрессировал трансген в клет­ках ногтей и волос (Чан, 2001).

В 2002 г. был предложен простой и эффективный метод получения трансген­ных мышей, крыс и других животных путем инфицирования оплодотворен­ных яйцеклеток с помощью рекомбинантного лентивирусного вектора. 10-100 пкл раствора данного вектора, содержащего ген GFP, вводили непо­средственно под блестящую оболочку зигот мышей. 80% полученных таким образом потомков оказались трансгенными, почти у всех потомков была обнаружена экспрессия трансгена (Луи и др., 2002).

В результате прогресса в развитии трансгеноза появились возможности для крупномасштабных изменений генома, включая манипуляции с фраг­ментами или целыми хромосомами. Последняя технология получила название хромосомная инженерия. Ей способствовала разработка подходов к созданию искусственных хромо­сом млекопитающих, обязательными элементами которых являются цент­ромера, теломеры и ori репликации. Искусственные хромосомы предостав­ляют уникальную возможность для изучения взаимосвязи между хромосом­ными структурами и их функциями. Использование хромосомного трансге­ноза позволяет осуществлять перенос очень больших генов и целых класте­ров генов со всеми окружающими их природными генетическими элемента­ми. При этом также полностью исключается негативное влияние эффекта положения на трансген. Использование нового подхода на базе эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), получившего название опосредованного микроклетками транс­порта хромосом, позволило получать химерных мышей с целыми хромосо­мами человека или их фрагментами (трансхромосомные мыши). В частно­сти, были получены мыши, содержащие фрагменты хромосом человека с локусами легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, которые оказались способными синтезировать специфические человеческие антитела.

Молекулярные механизмы трансгеноза. При микроинъекции в пронуклеусы экзоген­ной ДНК встройка трансгена происходит, как правило, в единичный участок генома в виде тандемов (до 50 и более копий, расположенных чаще всего в ориентации голова-хвост). Единичные фрагменты ге­нов удается встраивать в геном при использовании в качестве вектора рет­ровирусов.

При этом в большинстве случаев чужеродная ДНК встраивается в произвольные участки генома. Между тем постепенно накапливаются данные, свидетельствующие о том, что существуют неко­торые «предпочтительные» зоны, с которыми интегрирует экзогенная ДНК. Таковыми, по-видимому, являются транскрибирующиеся участки ге­нома, "горячие" точки рекомбинации, области начала репликации, а также разнообразные повторяющие­ся последовательности. Последние облегчают встраивание трансгенов за счет механизмов негомологичной рекомбинации.

5. Трансгенные животные и моделирование заболеваний человека

Очень важным направлением использования трансгенных животных яв­ляется создание моделей различных патологий человека. Это, с одной сто­роны, позволяет подтвердить роль тех или иных генов в определенном забо­левании, а, с другой, создать модель, на которой можно более детально ис­следовать молекулярные механизмы нарушений и осуществлять целенапра­вленный подбор лекарственных средств. Использование для этих целей мышей важно с той точки зрения, что у них примерно такой же размер генома и такое же число генов, как у чело­века. В настоящее время с помощью трансгеноза осуществлено моделирова­ние множества различных заболеваний человека, таких, например, как рак груди, рак простаты, нейрофиброма, эритролейкемия. диабет и др.

На модели трансгенных животных проведены многочисленные исследо­вания по выяснению роли различных онкогенов в злокачественных переро­ждениях клеток млекопитающих. Благодаря этим экспериментам установ­лено, в частности, что отдельные онкогены, перенесенные в мышей и крыс, могут определять появление у трансгенных особей опухолей в тех тканях, где они экспрессируются. Так, ген с-тус под контролем регуляторных эле­ментов гена иммуноглобулина (гены иммуноглобулинов экспрессируются тканеспецифично в В-клетках) вызывал у трансгенных мышей лимфомы В- и пре-В-клеток, а этот же онкоген под контролем LTR вируса MMTV обу­словливал возникновение аденокарциномы в молочной железе самок, т.е. в том органе, где экспрессируются гены вируса MMTV.

С использованием трансгенных мышей продемонстрировано онкогенное свойство мутантного гена р53. В кооперации с онкогеном ras мутантный ген р53 вызывал злокачественное перерождение клеток. У 20% трансген­ных животных возникали аденокарциномы легких, остеосаркомы и лимфо­мы. Полученные данные позволили прийти к заключению о том, что нор­мальный ген р53 является не онкогеном, а антионкогеном, продукт которо­го инактивируется при наличии мутантного белка р53.

Другим примером моделирования патологий человека может служить болезнь Альцгеймера (БА), которая является наиболее распространенной причиной прогрессирующей деменции в пожилом возрасте. Была показана важная роль в этом мутаций в трех генах: АРР, пресенилинах 1 и 2 (PSEN 1 и 2). Первые попытки смоделировать БА у млекопитающих заключались в получении трансгенных мышей, экспрессирующих ген АРР, несущий мута­ции, приводящие к развитию заболевания у человека.

Такие мыши развивались нормально, но с возрастом накапливали множест­венные отложения нерастворимого амилоида, а также в ряде случаев демон­стрировали отклонения в поведении. Трансгенные мыши, несущие мутант-ный ген АРР, были использованы для разработки нового подхода к терапии БА - Р-амилоидной иммунизации.

Сообщалось о переносе целой экзогенной митохонд­риальной ДНК (мтДНК) в эмбрионы мышей. Цитопласты (энуклеированные клетки), несущие в мтДНК мутацию, связанную с энергетическим мета­болизмом, сливали с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) с инактивированными митохондриями. Затем эти ЭСК использовали для получения химер. В результате химерные мыши и их потомки име­ли ряд аномалий, сходных с клиническими проявлениями болезни человека, обусловленной аналогичной мутацией в мтДНК (Хирано, 2001).

Эмбриональные стволовые клетки и таргетинг генов. Все вышеперечисленные системы получения трансгенных животных имеют тот недостаток, что вводимая этими способами ДНК интегрируется с реципиентным геномом случайным образом, зачастую в виде множества ко­пий, часто наблюдаются перестройки трансгена, мутации в геноме хозяина вплоть до летальных. Вследствие этого нередко экс­прессия одного и того же трансгена может варьировать в широких пределах у трангенных животных до полного ее отсутствия. Однако в последнее деся­тилетие техника введения чужеродной ДНК в геном животных усовершен­ствовалась так, что стало возможным осуществлять направленное введение ДНК в любую желаемую часть генома или конкретного локуса.

Основой новой технологии послужило создание эмбриональных стволо­вых клеток (ЭСК). В 1981 г. одновременно в двух лабораториях были получены первые культуры клеток, выделенных из внутренней клеточной массы бластоцист мыши (Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981). Все ЭСК имеют нормаль­ный диплоидный кариотип, обладают активностями щелочной фосфатазы и теломеразы, экспрессируют ряд других маркеров, характерных для недиф­ференцированных клеток. Это состояние поддерживается в определенных условиях культивирования, в частности, при наличии в культуре фидерного слоя эмбриональных фибробластов и/или фактора ингибирования лейкемии LIF. При удалении последних ЭСК начинают дифференцироваться в много­клеточные агрегаты, состоящие из дифференцированных и недифференци­рованных клеток, называемые эмбриоидными телами. Несколько позднее были получены культуры эмбриональных герминативных клеток (ЭГК), выделенные из первичных половых клеток мыши (Donovan, 1994). Затем были выделены линии кле­ток, подобные ЭСК, из эмбрионов кролика, хомячка, норки, свиньи, коровы, овцы, обезьян и, наконец, в последние годы такие линии выделены из бластоцист и первичных половых клеток человека.

ЭСК и ЭГК сохраняют высокие плюрипотентные свойства при длитель­ном культивировании in vitro и, будучи вновь введенными в эмбрион, способ­ны формировать химер, участвуя в развитии тканей всех трех зародышевых листков, включая образование гамет. Однако способность ЭСК к формированию химер и наследованию этих клеток у их потомков твердо установлена пока только для ЭСК мы­шей.

Уникальная способность ЭСК сохранять длительное время in vitro свои плюрипотентные свойства открыла широкие возможности для различных манипуляций с их генами. Были разработаны пути и методы направленного введения чужеродной ДНК в ЭСК путем гомологичной рекомбинации с эк­зогенной ДНК. При трансформации ЭСК in vitro в результате такой рекомбинации происходит вставка эндогенной ДНК в «ген-мишень». Затем, после отбора ЭСК с модифицированным гено­мом, их инъецируют в полость бластоцисты другой линии мышей или агрегируют с зародышами более ранних стадий развития, после чего их пересаживают в матку приемной матери. Среди потомков отбирают химер­ных животных, в результате скрещивания которых получают гомозиготных мышей. Генотип гомозигот представлен исключительно модифицированными ЭСК. Общая схема осуществления на­правленного изменения генов у животных приведена на рис. 7.

Данная технология позволяет получать направленные изменения в лю­бом желаемом гене (технология «gene targeting» или «knock out»). Совокуп­ность перечисленных выше методов можно определить как генетическую модификацию генома на уровне индивидуальных генов. Они позволили при­менять, по крайней мере, к мышам такие два основных генетических подхо­да как «от фенотипа к гену» и «от гена к фенотипу». Это имело революцио­низирующее воздействие как в фундаментальных научных, так и во всевоз­можных прикладных исследованиях.

Рисунок 7 - Схема получения трансгенных мышей путем таргетинга генов в ЭСК[3]

В первую очередь технология таргетинга внесла существенный вклад в генетику мыши и анализ различных аспектов функции генов in vivo. В ре­зультате использования таргетинга генов были созданы многочисленные трансгенные мыши с различными целенаправленными изменениями генов, начиная от точечных мутаций и кончая хромосомными перестройками.

Важнейшим моментом в развитии методологии направленного изменения генов явилось создание различных технологий сайт-специфического встраивания генов, с помощью которых можно встраивать любой ген или участок ДНК в любой заданный сайт хромосомы. В результате внедрения в практику этих технологий в настоящее время получены принципиально новые данные о функции тысяч различ­ных генов.

Таким образом, генный нокаут, как и перенос новых генов, митохондрий и целых хромосом, позволяет не только определять функцию гена, но и мо­делировать многие патологии человека. В настоящий момент этот при­ем становится одним из ключевых в молекулярной генетике. Его чрезвы­чайная важность на данном этапе исследований определяется массовым переходом от исследований по структурной генетике к функциональной ге­нетике.

Трансгеноз и клонирование животных. Как известно, первая технология клонирования млекопитающих была разработана Вилмутом в 1997 г. Сама техника клонирования была основана на переносе ядер соматических клеток донора в цитоплазму энуклеированного ооцита реципиента.

Альтернативным подходом к решению этой проблемы явилась трансформация чужеродными генами клеток фибробластовпло­дов с последующей пересадкой их ядер в энуклеированные ооциты овец и коров (1998), что привело к рождению транс­генных потомков. Вскоре появилось первое сообщение (МакКрет и др., 2000) о целенаправленном введении в клеточную культуру фибробластов плода овцы вектора, созданного на ос-нове альфа -1-проколлагенового гена ов­цы, содержащего в своем составе ген aльфа -1-антитрипсина человека под промо­тором бета-лактоглобулина. Были отобраны клоны фибробластов, прошедшие гомологичную рекомбинацию и экспрессирующие альфа- 1-антитрипсин челове­ка. Ядра этих фибробластов пересадили в энуклеированные ооциты овец, а эмбрионы, развившиеся из них до стадии морулы или бластоцисты, были перенесены суррогатным матерям для их дальнейшего развития. Из 16 про­анализированных плодов и новорожденных 15 содержали в своем геноме таргетированную аллель. 14 потомков развилось до рождения, и трое из них достигли годовалого возраста. У одной из самок был обнаружен в молоке aльфа -1-антитрипсин в количестве 650 мкг/мл.

Аналогичным путем были получены трансгенные свиньи, в которых был нокаутирован один аллель локуса aльфа -1,3-галактозилтрансферазы, от­ветственной за острую реакцию отторжения органов при ксенотрансплан­тации. Трансгенные особи были получены с использованием техники кло­нирования, когда в качестве доноров ядер были использованы нокаутиро­ванные по данной аллели клетки фибробластов плода свиньи (Лей и др., 2002).

Таким образом, за последние два – три десятилетия научные достижения в эм­бриологии, молекулярной биологии, генетике и структурной геномике, поя­вление новых методов и подходов в трансгенной технологии модификации генома животных создали основу для решения большого числа общебиоло­гических, биомедицинских и биотехнологических задач. Если генная инже­нерия послужила основой для развития структурной геномики, то трансгеноз стал основной технологией, способствующей прогрессу в функциональ­ной геномике. Без всякого сомнения, в ближайшие годы широкое примене­ние и дальнейшее развитие получат такие направления, как классический трансгеноз, направленный таргетинг генов в определенных типах клеток и/или на определенных стадиях развития организмов.

Технология получения трансгенных животных с заданными хозяйст­венно ценными признаками будет в дальнейшем одним из перспективных направлений современной биотехнологии. Она позволит создавать разно­образные организмы, обладающие свойствами, не имеющими аналогов в природе. Трансгенные животные помогут решению ряда проблем, с ко­торыми человечество сталкивается на всем протяжении своей истории. Это, прежде всего проблема создания лекарственных препаратов и их по­лучения в достаточном количестве, а также потенциально - продовольст­венная проблема.

Сочетание же клонирования с трансгенозом может стать очень эффе­ктивным путем как для дальнейшего развития функциональной геномики, так и для решения различных прикладных задач. В перспективе эти подхо­ды, наряду с генной терапией, могут быть весьма полезными для клеточной и органной терапии человека.