Изучение фагов

1 этап: выделение фага из исследуемого материала

Материалом, из которого выделяют фаг, являются фильтраты, полученные с помощью бактериальных фильтров из объектов внешней среды, органов и выделений человека. Цель: отделить фага от посторонней микрофлоры исследуемого материала.

Подготовка материала к работе:

а) жидкий исследуемый материал: кровь, моча, вода, смывы и т. д. освобождают от крупных частиц с помощью стерильного бумажного фильтра или центрифугированием, затем фильтруют через бактериальный фильтр, на котором задерживается посторонняя микрофлора, а в фильтрате предполагаем присутствие фага, который проходит через поры бак.фильтра.

б) вязкий материал: кал эмульгируют в стерильном физ.растворе, затем фильтруют через обычные стерильные фильтры (бумажные, ватно-марлевые), после чего фильтруют через бак.фильтры. Далее исследуем фильтрат.

в) плотный материал: кусочки органов, пищи растирают в ступке со стерильным кварцевым песком, затем эмульгируют в стерильном физ.растворе, освобождают от взвеси, фильтруют через бак.фильтр. Далее работаем с фильтратом.

2 этап: качественные реакции на фаг

Необходимо установить присутствие или отсутствие фага в фильтрате. О наличии фага в нем узнаем по лизису чувствительной к нему микробной культуре.

Обнаружение фага на плотной среде по Отто:

1. В чашку Петри внести питательную среду и засеять родственную искомому фагу культуру широким газоном.

2. Посев подсушить в термостате 30-40 минут при открытой крышке.

3. На поверхность посева нанести несколько капель исследуемого фильтрата и дать впитаться каплям несколько минут.

4. Поместить пробирки в термостат на 12-20 часов.

Учет: если в фильтрате есть фаг, то произойдет лизис культуры и на местах нанесения капель фильтрата появятся «стерильные» пятна, т. е. отсутствие роста родственной культуры. Могут появится негативные колонии фаг.

Обнаружение фага в жидкой среде по Уварову:

1. В две пробирки с бульоном внести по одной капле культуры микроба, родственного искомому фагу.

2. В одну из пробирок добавить исследуемый фаг или фильтрат. Другая пробирка будет контролем роста культуры.

3. Поместить пробирки в термостат на 12-20 часов.

Учет: в контрольной пробирке рост культуры — помутнение среды. Отсутствие роста в другой пробирке, куда вносили фильтрат, свидетельствует о наличии фага в фильтрате.

3 этап: определение активности фага (количественный метод)

Количественный метод имеет большое значение. Например, врачу нужно знать активность фага, чтобы правильно установить его дозу при лечебно-профилактическом применении.

Активность фага выражают понятием «титр», различая титр фага в жидкой и на плотной среде.

Титр фага по Аппельману (в жидкой среде) — это наибольшее (максимальное) разведение его, способное подавлять рост родственной ему культуры.

Титрование фага по Аппельману (постановка опыта).

Для опыта ставят в штатив десять рабочих пробирок и две — контрольные.

1. В десять рабочих пробирок внести по 4,5 стерильного буьльона.

2. В первую пробирку внести 0,5 мл фильтрата фага.

3. Сменив пипетку, перемешать содержимое в пробирке и перенести из нее 0,5мл во вторую пробирку. Сменив пипетку, 0,5 мл из второй пробирки перенести в третью и так далее включая десятую. Из десятой пробирки 0,5 мл вылить.

4. Во все пробирки внести по 1 капле родственной фагу культуры (тесткультуры)

5. В первую контрольную пробирку (КК — контроль культуры) внести 4,5 мл бульона и одну каплю культуры.

6. Во вторую контрольную пробирку (КФ — контроль фага и бульона на стерильность) внести 4,5 мл бульона и 0,5 мл фага.

7. Все пробирки ставят в термостат на 18-20 часов при 37 градусах Цельсия.

Учет: начинаем с контрольных пробирок. КК — мутный, КФ — прозрачный. Далее регистрируем характер изменений в рабочих пробирках, изучая их слева направо. Устанавливают титр фаг, т. е. его максимальное разведение, которое лизирует тест-культуру (это последняя прозрачная пробирка в ряду). Например, последняя прозрачная пробирка в ряду — восьмая, тогда титр фага по Аппельману равен 8.

Титрование фага по Грация (на плотной среде).

Этот метод позволяет определить количество частиц фага в титруемом материале. Метод основан на том, что каждая частица фага в фильтрате дает зону просветления (лизиса) на чашке с ростом чувствительного к нему микроба.

1. В десять чашек Петри внести по 20 мл МПА и подсушить в термостате.

2. Исследуемый фаг (фильтрат развести от 10^-1 до 10^-10) провести десятикратные разведения (см. титрование по Аппельману).

3. По 1 мл из каждого разведения фага перенести в другие пронумерованные пробирки из первой с фагом перенести в первую пустую пробирку и так далее до десятой.

4. Во все пробирки с 1 мл фильтрата внести по 2,5 расплавленного и остуженного до 45 градусов Цельсия 0,7% МПА, перемешать и вылить вторым слоем на поверхность МПА в соответствующим образом пронумерованные чашки Петри.

5. Через 30 минут чашки поставить в термостат на 18-20 часов при 37 градусах Цельсия.

Учет: подсчитывают на чашках «стерильные» пятна или колонии фага. Если на чашке с разведением 10^-4 выросло 25 колоний фага, то в 1 мл будет 25*10⁴. Так подсчитывают на каждой чашке, затем величины суммируют и делят на число чашек.