Робота № 75. Отримання первинного калюсу

Основні відомості. Основним типом рослинної культури in vitro є калюсна. Вона використовується як вихідний матеріал для отримання суспензійної культури, ізольованих протопластів, сполук вторинного синтезу, проведення клітинної селекції для отримання нових форм рослин тощо.

У відповідь на поранення паренхімні клітини дедиференціюються, переходять до проліферації, внаслідок чого утворюється первинна калюсна тканина. Утворення та ріст калюсу регулюються певним співвідношеннням ауксинів і цитокінінів. За допомогою цих речовин можна індукувати утворення калюсу тими тканинами рослини, які його не утворюють у разі поранення. Для отримання калюсу використовують середовища Уайта,

Мурасиге і Скуга, Гамборга та інші, доповнені регуляторами росту. Для індукції калюсоутворення слід використовувати живильні середовища з високим співвідношенням ауксину і цитокініну (10:1). Утворення калюсу залежить також від розмірів експлантата. Розмір первинного експлантата, 5...10 мм³, а маса – 20...100 мг.

Мета роботи. Отримати калюсну тканину з експлантатів листкового, стеблового, черешкового і міжвузлового походження; порівняти частоту калюсоутворення на експлантатах різного походження.

Матеріали, реактиви, обладнання. Асептичні рослини картоплі, гвоздики або тютюну; чашки Петрі зі стерильним середовищем для калюсу, стерильні чашки Петрі, скальпелі, пінцети, леза, спирт, спиртівка, ламінар-бокс, парафілм.

Хід роботи.

1. Стерильним пінцетом дістати рослину із пробірки (картопля, гвоздика) або баночки (тютюн) і помістити у стерильну чашку Петрі.

2. Підтримуючи рослину пінцетом, скальпелем розрізати її на експлантати: стебло, міжвузля, листок і черешок (5.10 мм). На листках зробити додаткові надрізи.

3. Експлантати помістити у чашки Петрі з калюсогенним середовищем.

4. Закрити чашки та підписати їх.

5. Чашки Петрі з рослинним матеріалом культивувати у термостаті за температури 25°±1 °С.

6. За 25…30 діб візуально визначити частоту калюсоутворення на експлантатах. Результати записати у таблицю.

Таблиця. Частота калюсоутворення на експлантатах різного походження

Номер досліду	Тип експлантата	Загальна кількість експлантатів	Кількість експлантатів, що утворили калюс	Індекс росту
штук	%

За підсумками роботи зробити висновки.

Контрольні питання

1. Що таке калюс?

2. Які зміни відбуваються у спеціалізованій клітині під час переходу до дедиференціації?

3. Із яких органів рослини можна отримати калюсну тканину?

4. Які фітогормони індукують утворення калюсної тканини?

5. Чим відрізняються середовища для вирощування рослин від середовищ для вирощування калюсу?

Контрольні питання до розділу «Фітобіотехнологія»

1. Назвіть загальні принципи організації біотехнологічної лабораторії.

2. Які елементи обов’язково входять до складу живильного

середовища.

3. Назвіть основні суміші вітамінів, які додають до живильного середовища?

ває на склад живильного середовища?

5. Які фітогормони використовують для росту і диференціації рослинних клітин?

6. На які групи розділяють рослинні тканини за потребою у фітогормонах?

7. Чим обумовлене обмежене використання рослинних екстрактів як стимуляторів росту?

8. У яких випадках до складу живильного середовища додається активоване вугілля?

9. Для вивчення яких процесів використовують культуру ізольованих коренів?

10. Чому перевага надається культивуванню in vitro пилку, а не пиляків?

11. Для яких цілей використовують культуру ізольованих меристем?

12. Що таке протокорм?

13. Яке практичне використання пухких калюсів?

14. Назвіть методи культивування одиночних клітин.

15. Які показники визначають для оцінки росту суспензійної культури?

16. Що таке ізольований протопласт?

17. Що таке соматична гібридизація?

18. Назвіть переваги клітинної селекції над традиційною селекцією.

19. Які типи культур використовують як вихідний матеріал для проведення клітинної селекції?

20. Що таке сомаклональна мінливість?

21. Назвіть способи генетичної трансформації.

22. Що таке плазміда?

23. Схарактеризуйте соматичний ембріогенез як спосіб мікроклонального розмноження рослин.

24. Які типи культур in vitro використовують для отримання речовин вторинного синтезу?

25. Назвіть способи оцінки життєздатності рослинних клітин після розморожування.