Лабораторные работы. Лабораторная работа № 1. Качественная реакция на желчные кислоты

Лабораторная работа № 1. Качественная реакция на желчные кислоты

Принцип метода. При взаимодействии желчной кислоты с оксиметилфурфуролом, образующимся из тростникового сахара под действием концентрированной серной кислоты, появляется красно-фиолетовое окрашивание (реакция Петтенкофера).

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с концентрированной серной кислотой.

Ход работы. В сухую пробирку (под которую подложен лист белой бумаги) вносят 2 капли желчи, 2 капли 20 %-го раствора сахарозы и тщательно перемешивают стеклянной палочкой, а затемприливают 7 капель концентрированной серной кислоты иперемешиваютэтойже стеклянной палочкой. Через 2-3 мин появляется красная окраска, переходящая при стоянии в красно-фиолетовую.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагности­ческую оценку.

Лабораторная работа № 2. Влияние желчи на активность липазы

Принцип метода. Липаза ускоряет гидролиз нейтрального жира на глицерин и жирные кислоты (см. уравнение), что приводит к снижению pH и исчезновению розовой окраски индикатора – фенолфталеина. Активность панкреатических липаз, определяемых титрометрически, резко возрастает при действии желчных кислот.

Ход работы. Готовят три колбы – две опытные и одну контрольную. В них смешивают препарат липазы и субстрат (молоко или подсолнечное масло), как указано в таблице 1.

Таблица 1

Состав инкубационной смеси, мл	Опытные пробы	Контроль
без желчи	с желчью
Молоко разведенное (1:10)
Глицериновый экстракт поджелудочной железы			1*
Раствор желчи	-
Вода		-
* Экстракт предварительно кипятят 10 мин для инактивации липаз.

Приготовленные инкубационные смеси тщательно перемешивают. Затем из каждой колбы отбирают по 1 мл смеси в заранее приготовленные стаканчики для титрования. Добавляют в каждый стаканчик по 1-2 капли раствора фенолфталеина и титруют 0,01М раствором NaOH до слабо-розового окрашивания. При первом титровании нейтрализуются органические кислоты – молочная и другие, которые присутствовали в молоке до начала действия липазы.

Оставшуюся в колбах смесь помещают в термостат (при t = 40 °C) и через определенные интервалы времени (15, 30, 90 мин) отбирают из каждой колбы (не извлекая их из термостата) по 2 мл смеси и титруют 0,01М раствором NaOH. Время титрования и объем израсходованного NaOH фиксируют в таблице 2.

Таблица 2

Время инкубации, мин	Объем (мл) 0,01М NaOH, пошедшего на титрование
Опытные пробы	Контроль
без желчи	с желчью

Результаты первого титрования, полученные до начала действия липаз, вычитают из результата последующих титрований.

На основании полученных данных строят график, где по оси абсцисс откладывают время (в минутах), а по осиординат – активность липазы, выраженную объемом (мл) 0,01 М раствора NaOH, пошедшего на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся за данный отрезок времени. Сравнивают активность липазы в присутствии желчи и без нее.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагности­ческую оценку.

Лабораторная работа № 3. Эмульгирование жира

Принцип метода. Эмульгирование жира различными амфифильными веществами происходит благодаря их адсорбции на границе раздела двух фаз – гидрофобной и гидрофильной.

Ход работы. В пять пробирок вносят по 1 капле растительного масла. Затем в каждую пробирку соответственноприливают по 1-2 капли растворов NaOH, NaHCO₃, яичного белка, моющего средства и желчи. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и наблюдают образование эмульсии жира. Объясните механизм образованияэмульсии жира в этих растворах и значение процесса эмульгирования.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагности­ческую оценку.

Рекомендуемая литература

Основная

1 Материал лекций.

2 Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 276–291; 1998. С. 363–372, 574–576.

3 Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 263–266, 270–273, 280–281.

Дополнительная

4 Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 363–380.

5 Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 1. С. 151–164, 256–266.

6 Руководство по клинической и лабораторной диагностике. Т. 3. Клиническая биохимия. Киев: Вища школа, 1986. С. 96–109.

7 Методическое пособие по метаболизму липопротеидов. Гомель, 1996.

8 Албертс Б. и др., Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 1. С. 349–429.