VII. Оп­ре­де­ле­ние мо­ле­ку­ляр­ной мас­сы бел­ков

Мо­ле­ку­ляр­ная мас­са бел­ков яв­ля­ет­ся очень боль­шой ве­ли­чи­ной и из­ме­ря­ет­ся в даль­то­нах (1 Даль­тон = 1 а.е.м.). Точ­ное ус­та­нов­ле­ние её – дос­та­точ­но слож­ная за­да­ча, тре­бую­щая вы­яс­не­ния пер­вич­ной струк­ту­ры бел­ка, что не все­гда пред­став­ля­ет­ся воз­мож­ным. По­это­му ча­ще все­го поль­зу­ют­ся при­бли­зи­тель­ным зна­че­ни­ем мо­ле­ку­ляр­ной мас­сы бел­ков – так на­зы­вае­мым фи­зи­че­ским зна­че­ни­ем мо­ле­ку­ляр­ной мас­сы бел­ка; она оп­ре­де­ля­ет­ся с точ­но­стью до не­сколь­ких со­тен, а ино­гда и ты­сяч даль­тон.

Су­ще­ст­ву­ет мно­же­ст­во бо­лее или ме­нее точ­ных спо­со­бов оп­ре­де­ле­ния мо­ле­ку­ляр­ной мас­сы бел­ков. Пе­ре­чис­лим не­ко­то­рые из них:

– вис­ко­зи­мет­ри­че­ский (не­точ­ный ме­тод; оп­ре­де­ля­ет­ся вяз­кость бел­ко­во­го рас­тво­ра, а по ней рас­счи­ты­ва­ет­ся мо­ле­ку­ляр­ная мас­са);

– оп­ти­че­ский (не яв­ля­ет­ся уни­вер­саль­ным; оце­ни­ва­ет­ся све­то­рас­сеи­ваю­щая спо­соб­ность бел­ко­во­го рас­тво­ра);

– хи­ми­че­ский (ко­ли­че­ст­вен­но оп­ре­де­ля­ют хи­ми­че­ский эле­мент или ами­но­кис­ло­ту, со­дер­жа­щую­ся в бел­ке в наи­мень­шем ко­ли­че­ст­ве; за­тем про­из­во­дят рас­чет мо­ле­ку­ляр­ной мас­сы, ис­хо­дя из то­го, что в мо­ле­ку­ле бел­ка не мо­жет быть мень­ше од­но­го ато­ма дан­но­го эле­мен­та или од­но­го ами­но­кис­лот­но­го ос­тат­ка; ме­тод не то­чен и да­ёт крат­ные ошиб­ки, по­сколь­ку не учи­ты­ва­ет­ся точ­ное чис­ло ато­мов и ами­но­кис­лот­ных ос­тат­ков);

– гель­фильт­ра­ци­он­ный (со­сто­ит в оп­ре­де­ле­нии объ­е­ма элю­ен­та, не­об­хо­ди­мо­го для вы­но­са бел­кам из ко­лон­ки с се­фа­дек­сом и со­от­не­се­нии его со сво­бод­ным объ­е­мом ко­лон­ки; да­лее ре­зуль­тат со­от­но­сят с ка­либ­ро­воч­ны­ми гра­фи­ка­ми для из­вест­ных бел­ков и оп­ре­де­ля­ют мо­ле­ку­ляр­ную мас­су бел­ков);

Са­мым точ­ным спо­со­бом оп­ре­де­ле­ния, пред­ло­жен­ным еще в 20-е го­ды про­шло­го ве­ка Т. Свед­бер­гом, яв­ля­ет­ся гра­ви­мет­ри­че­ский. Он ос­но­ван на ульт­ра­цен­три­фу­ги­ро­ва­нии бел­ко­во­го рас­тво­ра. Бел­ко­вый рас­твор ок­ра­ши­ва­ют оп­ре­де­лен­ным спо­со­бом и по­ме­ща­ют в не­боль­шую про­зрач­ную для све­то­вых лу­чей ячей­ку, ко­то­рую встав­ля­ют в спе­ци­аль­ное гнез­до ро­то­ра ульт­ра­цен­три­фу­ги. Ро­тор на­чи­на­ет вра­щать­ся с ог­ром­ной ско­ро­стью, обес­пе­чи­вая цен­тро­беж­ное ус­ко­ре­ние в 300 тыс. – 1 млн. 200 тыс. раз пре­вы­шаю­щее ус­ко­ре­ние си­лы тя­же­сти. Под дей­ст­ви­ем та­ко­го ус­ко­ре­ния час­ти­цы бел­ка дос­та­точ­но бы­ст­ро осе­да­ют на дно. Фо­то­при­став­ка к ульт­ра­цен­три­фу­ге по­зво­ля­ет де­лать сним­ки со­дер­жи­мо­го яче­ек че­рез оп­ре­де­лен­ные ин­тер­ва­лы вре­ме­ни и фик­си­ро­вать та­ким об­ра­зом ско­рость осе­да­ния (се­ди­мен­та­ции) мо­ле­кул бел­ка.

Оп­ре­де­ле­ние мас­сы бел­ка с по­мо­щью ульт­ра­цен­три­фу­ги ве­дут дву­мя спо­со­ба­ми:

– по ско­ро­сти се­ди­мен­та­ции мо­ле­кул;

– по се­ди­мен­та­ци­он­но­му рав­но­ве­сию.

В пер­вом слу­чае на­хо­дят кон­стан­ту се­ди­мен­та­ции s:

,

где u – ско­рость пе­ре­ме­ще­ния бел­ко­вых мо­ле­кул в про­цес­се ульт­ра­цен­три­фу­ги­ро­ва­ния; w²r – цен­тро­беж­ное ус­ко­ре­ние, см/с², – ве­ли­чи­на, яв­ляю­щая­ся тех­ни­че­ской ха­рак­те­ри­сти­кой при­бо­ра.

Раз­мер­ность кон­стан­ты се­ди­мен­та­ции s вы­ра­жа­ют в се­кун­дах. Счи­та­ет­ся, что 10^–13 сек – еди­ни­ца кон­стан­ты се­ди­мен­та­ции, на­зван­ная свед­бер­гом (св).

Мо­ле­ку­ляр­ная мас­са бел­ка по ме­то­ду Свед­бер­га с ис­поль­зо­ва­ни­ем экс­пе­ри­мен­таль­но най­ден­ной кон­стан­ты се­ди­мен­та­ции s рас­счи­ты­ва­ет­ся сле­дую­щим об­ра­зом:

,

где R – уни­вер­саль­ная га­зо­вая по­сто­ян­ная, T – аб­со­лют­ная тем­пе­ра­ту­ра, D – ко­эф­фи­ци­ент диф­фу­зии (за­ви­сит от ис­поль­зуе­мо­го рас­тво­ри­те­ля), r – плот­ность ис­поль­зуе­мо­го рас­тво­ри­те­ля, s – плот­ность бел­ко­вых час­тиц или ок­ра­шен­но­го рас­тво­ра.

С по­мо­щью ульт­ра­цен­три­фу­ги­ро­ва­ния мож­но оп­ре­де­лить мо­ле­ку­ляр­ные мас­сы лю­бых рас­тво­ри­мых бел­ков, вы­де­лен­ных в ин­ди­ви­ду­аль­ном со­стоя­нии. Для дос­ти­же­ния мак­си­маль­но­го ре­зуль­та­та и пре­дот­вра­ще­ния оши­бок мо­ле­ку­ляр­ную мас­су бел­ков на­хо­дят не­сколь­ки­ми спо­со­ба­ми, сум­ми­ру­ют по­лу­чен­ные ре­зуль­та­ты и на­хо­дят сред­нее ариф­ме­ти­че­ское зна­че­ние мас­сы (при ус­ло­вии схо­ди­мо­сти ре­зуль­та­тов).