Практичне заняття №13. Тема: «Спірохети. Мікробіологічна діагностика спірохетозів»

Тема: «Спірохети. Мікробіологічна діагностика спірохетозів»

1. Актуальність теми.

Патогенні спірохети належать до родини Spirochetaceae, порядку Spirochaetales. Родина складається з 5 родів. Збудники людини належать до 3 родів: Treponema (збудник сифілісу – T.pallidum, збудник фрамбезії – T.pallidum subsp. tenue, збудник пінти - T.carateum); Borrelia (збудник епідемічного поворотного тифу – B.recurrentis, збудники кліщового поворотного тифу – B.persica, B.hispanica та ін.) і роду Leptospira родини Leptospiraceae (збудник лептоспірозу - Leptospira interrogans). Захворювання, які викликають спірохети називаються спірохетозами. Вони мають певні спільні ознаки в патогенезі, клініці та епідеміології захворювань. Так, для спірохетозів характерний циклічний перебіг захворювань, особливо при поворотному тифі з повторними нападами лихоманки. Сифіліс також проходить у вигляді послідовних стадій. Наявність рецидивів спостерігається і при лептоспірозі. При всіх спірохетозах збудник виявляється в крові і тканинах. Поворотний тиф є типовою кров’яною інфекцією, передача якої можлива лише через кровососів (воші, кліщі). При сифілісі спірохети розмножуються в основному в тканинах, а на деяких стадіях перебувають у крові. При лептоспірозі спірохети також виявляють у крові і тканинах. Протягом практичної роботи лікар може зустрітися з різними спірохетозами. За даними Всесвітньої Організації Охорони Здоров’я кожного року в світі захворює на сифіліс 50 млн. людей, в Європі - 40 тисяч, а число незареєстрованих випадків значно більше. Сифіліс є маркером СНІДу, який спричиняє вірус імунодефіциту людини. Останнім часом набув поширення бореліоз – хвороба Лайма – збудник B.burgdorferi, зареєстровані спорадичні випадки поворотного тифу, широко розповсюджений лептоспіроз в Україні. Тому доцільним і необхідним є проведення практичного заняття, яке присвячене розгляду і засвоєнню студентами патогенезу, принципів лабораторної мікробіологічної діагностики спірохетозів (поворотного тифу, лептоспірозів і сифілісу). Все вище наведене зумовлює актуальність теми заняття та спрямоване на формування позитивної мотивації її вивчення.

2. Конкретні цілі:

· Засвоїти біологічні властивості кампілобактерів, гелікобактерів, спірохет, закономірності патогенезу, особливості імунітету, методи діагностики кампілобактеріозів, гелікобактеріозів, сифілісу, поворотного тифу та лептоспірозу.

· Оволодіти методами лабораторної діагностики сифілісу, поворотного тифу та лептоспірозу.

· Вивчити препарати, що використовуються для діагностики, специфічної профілактики та терапії кампілобактеріозів, гелікобактеріозів, спірохетозів.

3. Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція). Дивись практичне заняття №11.

4. Завдання для самостійної роботи під час підготовки до заняття.

4.1 Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:

Термін	Визначення
Патогенні спірохети	Патогенні спірохети – це тонкі, звивисті, рухомі мікроорганізми, які відрізняються один від одного за розмірами, глибиною спіралі, амплітудою і кількістю вигинів. Спірохети розрізняють також за реакцією на зафарбування. За методом Романовського-Гімзе добре зобарвлюються борелії – в синьо-фіолетовий колір – і дуже слабо трепонеми – в блідо-рожевий колір. В живому стані патогенні спірохети можна виявити при мікроскопії досліджуваного матеріалу в темному полі зору. Рухомі мають 4 види руху: поступальний, згинальний, обертовий і маятникоподібний.
Сифіліс	Сифіліс - це венеричне інфекційне захворювання,при якому уражається шкіра, слизові оболонки, внутрішні органи і центральна нервова система. Слово “сифіліс” вперше з’явилося в поемі видатного італійського вченого, лікаря, філософа і поета з Верони Джіроламо Фракасторо "Сифіліс”, або “французька хвороба”, яка видана у Венеції в 1530 р. За ім’ям героя поеми пастуха Сіфіла, якого боги покарали хворобою статевих органів (Suis – свиня, philos – люблячий), хворобі присвоєно назву “сифіліс”.
Збудник сифілісу	Збудник сифілісу – це Treponema pallidum, яка входить до роду Treponema (від лат. trepo - повертати, nemo - нитка) відкритий в 1905 р. Ф.Шаудіном і Е.Гофманом. Стара назва збудника – бліда спірохета зумовлена тим, що мікроорганізм погано забарвлюється барвниками внаслідок низького вмісту нуклеопротеїдів. Treponema pallidum – тонкі клітини спіралеподібної форми з 12-14 завитками.
Поворотні тифи	Поворотні тифи – гострі, кров’яні трансмісивні інфекції, які викликають борелії і характеризуються загальною інтоксикацією, повторними нападами лихоманок – гарячок, які чергуються з без температурними періодами (днями) – немовби
	видужанням, різним ступенем ураження печінки і селезінки, інколи жовтяницею, менінгітом, ураженням інших органів. Заразність крові хворого була доведена в 1874 р. Г.М.Мінхом в Одесі, в дослідах самозараження.
Збудники поворотного тифу	Борелії поворотного тифу – це збудники бореліозів. Епідемічний (вошивий) поворотний тиф викликає Borrelia recurrentis, а ендемічний – В.persica, B.duttoni, B.caucasica. Збудники поворотного тифу відрізняються від трепонем наявністю великих пологих нерівномірних завитків, кількість яких становить від 3 до 10.
Лептоспіроз	Лептоспіроз – це гостре інфекційне зоонозне захворювання, яке характеризується лептоспіремією, лихоманкою, інтоксикацією, ураженням нирок, капілярів печінки, м’язів, серцево-судинної і центральної нервової систем.
Збудники лептоспірозу	Лептоспіри – збудники гострих інфекційних захворювань лептоспірозів, які уражають людину, гризунів, велику рогату худобу, овець, свиней, собак та інших тварин. Викликається лептоспіроз збудником Leptospira interrogans (грец. leptos - довгий, тонкий). Збудниками лептоспірозу часто є L.pomona, L.monijakov, L.grippotyphosa, L.tarassovi, L.canicola, L.icterohaemorragiae. Лептоспіри – довгі, тонкі спіралеподібні мікроорганізми з 12-18 дрібними завитками. Кінці їх загнуті у вигляді крючків.

4.2. Теоретичні питання до заняття.

1.Характеристика кампілобактерів: класифікація, морфологія, антигенний склад, біохімічна активність, культуральні властивості, патогенез кампілобактеріозів, мікробіологічна діагностика.

2. Характеристика гелікобактерів: класифікація, морфологія, культуральні властивості, патогенез виразкової хвороби шлунку, методи діагностики захворювань гелікобактерної природи, лікування гелікобактеріозів.

3. Патогенні спірили.Збудник гарячки від укусу щурів (хвороби Содоку). Мікробіологічна діагностика захворювання.

4. Загальна характеристика родини спірохет. Класифікація.

5. Історичні дані про збудників поворотного тифу, сифілісу, лептоспірозів.

6. Збудник сифілісу. Біологічні властивості. Патогенез і імунітет. Мікробіологічна діагностика і специфічна терапія сифілісу.

7. Лептоспіри, їх характеристика, класифікація. Патогенез, імунітет і мікробіологічна діагностика лептоспірозів. Специфічна профілактика і терапія.

8. Борелії, біологічні властивості. Роль в патології людини. Збудники епідемічного і ендемічного поворотних тифів, хвороби Лайма. Патогенез, імуногенез, мікробіологічна діагностика поворотного тифу, хвороби Лайма. Специфічна профілактика і терапія.

4.3.Практичні завдання, які виконуються на занятті:

· Створити схеми мікробіологічної діагностики сифілісу, поворотного тифу та лептоспірозів.

· Ознайомитися з методами бактеріоскопічної діагностики сифілісу та поворотного тифу.

· Оволодіти методикою серологічної діагностики сифілісу методом постановки реакції Вассермана.

· Вивчити препарати, які використовують для діагностики, специфічної профілактики і терапії спірохетозів.

5. Зміст теми:

На практичному занятті студенти вивчають еволюцію і властивості представників звивистих форм бактерій; історію відкриття та вивчення кампілобактерів, гелікобактерів, спірохет; біологічні властивості кампілобактерів, гелікобактерів, спірохет; закономірності патогенезу, особливості імунітету, методи діагностики кампілобактеріозів, гелікобактеріозів, сифілісу, поворотного тифу та лептоспірозу; препарати для діагностики, специфічної профілактики та терапії кампілобактеріозів, гелікобактеріозів, спірохетозів. Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.

Рекомендації для оформлення протоколу

В протокол необхідно внести:

1. Класифікацію звивистих форм бактерій, патогенних для людини.

2. Класифікацію патогенних представників родини Spirochetaceae

3. Особливості мікробіологічної діагностики кампілобактеріозів, гелікобактеріозів і спірохетозів.

4. Малюнок мікроскопічного препарату, виготовленого з крові хворого на поворотний тиф і висновок про результати мікроскопії.

5. Малюнок мікроскопічного препарату, виготовленого з матеріалу хворого на сифіліс (з твердого шанкру), і висновок про виявленого мікроба.

6. Схеми мікробіологічної діагностики сифілісу, поворотного тифу та лептоспірозів.

7. Схему постановки основного досліду реакції Васермана.

8. Таблицю диференціації епідемічного і ендемічного поворотного тифу.

9. Препарати, які використовуються для діагностики, лікування і специфічної профілактики сифілісу, поворотного тифу та лептоспірозів.

Таблиця 1. Класифікація звивистих форм бактерій, патогенних для людини

Вібріони. Кампілобактери. Хелікобактери. Спіріли. Спірохети: Трепонеми. Борелії. Лептоспіри.

Таблиця 2. Класифікація патогенних представників родини Spirochetaceae

Рід	Вид	Підвид	Захворювання
Treponema	pallidum pallidum carateum vincentii	pallidum pertenue	Сифіліс Фрамбезія Пінта Ангіна Венсана-Плаута
Borellia   Borellia	recurrentis   caucasica, duttoni, persica та ін.		Епідемічний (вошивий) поворотний тиф   Ендемічний (кліщовий) поворотний тиф
Borellia	burgdorferi		Хвороба Лай
Leptospira	Icterohaemorrhagiae		Лептоспіроз

Таблиця 3. Мкробіологічна діагностика захворювань, викликаних C. jejuni та спорідненених бактерій

Метод діагностики	Характеристика
1.Бактеріоскопія (орієнтовна діагностика)	Грамнегативні вібріоподібні мікроорганізми. Монотрихи. Стрімка рухливість.
2.Бактеріологічна діагностика (основна)	Визначення біологічних, біохімічних, серологічних властивостей виділеної чистої культури:оксидазопозитивні; ростуть при 420 (крім C.fetus, яка не росте при 420, але росте при 250С); враховують чутливість до налідоксової кислоти.
3. Серологічна діагностика	Для підтвердження бактеріологічного діагнозу, використовують рідко ІФА, РІФ, РНГА та ін.
4. Генетична діагностика	Полімеразна ланцюгова реакція

Таблиця 4. Методи діагностики захворювань викликаних Helicobacter pylori

Бактеріологічний	Виділення збудника
Гістологічний	Виявлення збудника в гістологічних зрізах біоптатів
Уреазний	Виявлення біохімічної активності збудника в біоптатах
Дихальний тест	Виявлення уреазної активності збудника в шлунку хворого за допомогою ізотопів вуглецю (13С, 14С)
Імунологічний	ІФА, антигенів збудника в фекальних масах
Генетичний (Полімеразна ланцюгова реакція)	Матеріал з біоптатів

Особливості мікробіологічної діагностики спірохетозів (сифілісу, лептоспірозу, поворотного тифу)

Мікробіологічна діагностика сифілісу

1. Мікроскопія (нативний і фіксований матеріал)

- фазовий контраст

- темне поле

2. Серологічна діагностика

- Імуноферментний аналіз (ІФА)

- Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА)

- Реакція Вассермана

- Осадові реакції (Кана і Закса-Вітебського)

- Реакції іммобілізації блідої трепонеми (РІТ)

- Реакція імунофлюоресценції (РІФ)

3. Плімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

Мікробіологічна діагностика поворотного тифу: бактеріоскопічний і серологічний принципи.

Таблиця 5. Диференціація епідемічного і ендемічного поворотного тифу

Ознаки	Епідемічний поворотний тиф	Ендемічний(кліщовий) поворотний тиф
Збудник	B.recurrentis	B.persica, B.caucasica
Переносник	Pediculus vestimenti і рідше P.capitis	Alectorobius Alectorobius papillipes verrucosus
Патогенність для морської свинки (біологічний метод)	Не хворіє	Захворювання настає через 5-7 діб (введення 0,5 см 3 крові підшкірно або 1-2 краплини у кон’юнктиву ока).
Наявність збудника в “товстій” краплі крові під час гарячкового періоду	Виявляється велика кількість спірохет	Поодинокі спірохети, але їх виявлення є можливим як під час нападу, так і в період між ними.
При огляді в темному полі зору мікроскопа	Наявність одного контура в спірохеті	Наявність двох контурів в спірохеті
Розповсюдження	Практично відсутній	Центральна, Середня Азія і Середземне море (B.persica); Кавказ, Україна (B.caucasica).

Мікробіологічна діагностика лептоспірозу: бактеріоскопічний (слабка чутливість) бактеріологічний і серологічний методи, ПЛР.

Завдання 1. Здійснити бактеріоскопічну діагностику сифілісу, дослідити морфологію мікробів у мікроскопі.

Схема виконання завдання

Матеріал (із шанкру, лімфатичних вузлів, елементів висипу)

препарат Темнопольна мікроскопія

Завдання 2. Здійснити бактеріоскопічну діагностику поворотного тифу, дослідити морфологію мікробів у мікроскопі.

Матеріал для дослідження

препарат з “товстої” краплі крові

Борелія поворотного тифу в крові,

забарвлення за методом

Романовського- Гімзи

Кров хворого

Завдання 3. Здійснити облік результатів реакції Васермана, з метою серологічної діагностики сифілісу (за схемою).

Для виконання реакції отримують сироватку крові, інактивують на водяному нагрівачі при 56⁰С 30 хв і розливають у 4 пробірки.

Використовується в реакції Васермана: 1) специфічний антиген, який містить антигени збудника – зруйновані ультразвуком трепонеми; 2) неспецифічний антиген – ліпоїдний екстракт з бичачого серця з лецетином і холестерином – кардіоліпідний антиген; 3) неспецифічний антиген – спиртовий екстракт ліпоїдів із м’язів серця бика з холестерином.

Таблиця №2

Схема виконання основного досліду реакції Васермана

Інгредієнти	Пробірка №1	Пробірка №2	Пробірка №3	Пробірка №4
Сироватка крові хворого, інактивована і розведена 1:5	0,5см3	0,5 см3	0,5 см3	0,5 см3
Антиген №1(специфічний)	0,5 см3	-	-	-
Антиген №2(неспецифічний)	-	0,5 см3	-	-
Антиген №3(неспецифічний)	-	-	0,5 см3	-
Комплемент (робоча доза)	0,5 см3	0,5 см3	0,5 см3	0,5 см3
Ізотонічний розчин NaCl (натрія хлориду)	-	-	-	0,5 см3

Термостат при температурі 37⁰ С упродовж 45 хв.

Гемолітична система сенсибілізована

1,0 см3

1,0 см3

1,0 см3

1,0 см3

Термостат при температурі 37⁰ С упродовж 1 год.

Результат:	Пробірка №1	Пробірка №2	Пробірка №3	Пробірка №4
з сироваткою хворого сифілісом	-Г	-Г	-Г	+Г
з нормальною сироваткою	+Г	+Г	+Г	+Г

Примітка: -Г гемолізу немає; + Г гемоліз; + додатний результат; - від’ємний результат. Облік результатів проводиться після настання гемолізу у всіх контролях.

У 50% хворих реакція стає додатною після появи твердого шанкру. В другому і третьому періодах сифілісу 75-90% додатних реакцій. Після лікування реакція Васермана від’ємна.

6. Матеріали для самоконтролю.

· Яке положення в системі мікроорганізмів займають патогенні звивисті бактерії?

· На які групи поділяють патогенні для людини спірохети?

· Історичні дані про збудників поворотного тифу, сифілісу та лептоспірозів?

· У чому полягають біологічні особливості збудників спірохетозів та критерії диференціації їх від сапрофітних мікроорганізмів такої ж морфології?

· Які є форми поворотного тифу, переносники та патогенез хвороби?

· Патогенез, клінічні форми сифілісу, імунітет.

· Які біологічні властивості у лептоспір?

· Патогенез, клінічні форми, імунітет, специфічна профілактика лептоспірозу, імунітет, специфічна профілактика.

· Який механізм імунітету при захворюваннях, викликаних трепонемами, бореліями та лептоспірами?

· Як можна обґрунтувати принципи мікробіологічної діагностики спірохетозів, лептоспірозів, гелікобактеріозів, кампілобактеріозів і які методи діагностики застосовують?

· Яке теоретичне обґрунтування терапії та профілактики спірохетозів, лептоспірозів, гелікобактеріозів і кампілобактеріозів?