Практичне заняття №12. Тема: «Рикетсії, мікоплазми, хламідії

Тема: «Рикетсії, мікоплазми, хламідії. Мікробіологічна діагностика рикетсіозів, мікоплазмозів, хламідіозів»

1. Актуальність теми.

Хламідіози, рикетсіози і мікоплазмози – це різні інфекційні захворювання, збудники яких, маючи певні біологічні властивості (в першу чергу, внутрішньоклітинний паразитизм), можуть довго персисту вати в організмі людини, викликаючи гострі і хронічні процеси, клінічні і безсимптомні інфекції і рецидиви.

Хламідії, рикетсії і мікоплазми відносяться до прокаріотів, але мають певні особливості, які їх відрізняють від звичайних бактерій. Так, рикетсії і хламідії в еволюційно-біологічному аспекті займають проміжне положення між бактеріями і вірусами. Вони, як і віруси, є облігатними внутрішньоклітинними паразитами, мікоплазми не мають клітинної стінки. Ці мікроорганізми важко вирощувати в лабораторних умовах. Все це ускладнює діагностику, профілактику і лікування захворювань, які вони викликають.

На території нашої країни реєструються трансмісивні рикетсіози (ендемічний висипний тиф, хвороба Брілля, Ку-гарячка та інші), хламідійні “орнітози”, трахоми, респіраторні та урогенітальні хламідіози, мікоплазма- і уреаплазма-інфекції. В останній час все актуальніше постають питання діагностики і лікування мікоплазмозів і хламідіозів, які передаються статевим шляхом.

На занятті студентам надається можливість ознайомитись з класифікацією, біологічними властивостями рикетсій, хламідій, мікоплазми, вивчити патогенез, діагностику, профілактику і лікування захворювань, які вони викликають.

Все це зумовлює актуальність теми заняття та спрямоване на формування позитивної мотивації її вивчення.

2. Конкретні цілі:

· Вивчити класифікацію і основні біологічні властивості рикетсій, хламідій і мікоплазм, ознайомитись з патогенезом і лікуванням захворювань, які вони викликають.

· Проаналізувати схеми мікробіологічної діагностики рикетсіозів, хламідіозів і мікоплазмозів.

· Ознайомитись з морфологічними і тинкторіальними властивостями рикетсій і хламідій в демонстраційних препаратах.

· Засвоїти методи серологічної діагностики висипного тифу і Ку-гарячки.

· Ознайомитись з препаратами, які використовують для діагностики, специфічної профілактики і лікування рикетсіозів.

3. Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція). Дивись практичне заняття №11.

4. Завдання для самостійної роботи під час підготовки до заняття.

4.1. Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:

Термін	Визначення
Rickettsia	Rickettsia (R.) – рід паразитичних бактерій з родини Rickettsiaceae, зазвичай мають коковидну форму розміром 0,3-0,6 х 0,8-2 мкм, але зустрічаються паличкоподібні і ниткоподібні клітини. Клітинна стінка побудована за типом грамнегативних бактерій. Здатні розмножуватись тільки в цитоплазмі чутливих клітин. В лабораторних умовах R. культивуються в жовтковому мішку курячого ембріона, культурах клітин (HeLa, HEp-2, Дейтройт-6), а також на лабораторних тваринах (мишах). Паразитують на кровоносних комахах (вошах, блохах, кліщах). Деякі види, патогенні для ссавців, викликають у них гострі інфекційні захворювання – риккетсіози.
Риккетсіози	Риккетсіози – група гострих інфекційних трансмісивних захворювань, збудниками яких є представники родини Rikcettsiaceae. В залежності від біологічних властивостей збудника, клінічної картини і епідеміології виділяють такі групи захворювань: 1. Епідемічний висипний тиф (вошивий; збудник R.prowazekii), спорадичний висипний тиф (рецидив епідемічного, збудник той же самий), ендемічний висипний тиф (блошиний, збудник – R.typhi). 2. Гарячка цуцу-гамуши (збудник R.tsutsugamuchi). 3. Група плямистих гарячок: Скалистих гір (збудник R.rickettsii), Марсельської гарячки (збудник R.conorii), Кліщовий рикетсіоз Північної Азії (збудник R.sibirica), Квінслендський кліщовий тиф (збудник R.australis), Оспоподібний рикетсіоз (збудник R.akari). 4. Гарячка Ку (збудник Coxiella burnetti). 5. Окопна гарячка (збудник R.guintana). При епідемічному висипному тифі резервуаром інфекції є людина, при всіх інших рикетсіозах – тварини (пацюки, інші гризуни, собаки, рогата худоба). Зараження людини відбувається через укус або втирання фекалій інфікованих комах. Тільки гарячка Ку може передаватися через об’єкти зовнішнього середовища.
Висипний тиф	Висипний тиф (реакція Вейля), (епідемічний, вошивий) – гостра особливо небезпечна інфекція, збудником якої є R.prowazekii. Збудник відноситься до роду Rickettsia, порядку Rickettsiales і характеризується притаманними їм властивостями. Розмножуються в цитоплазмі ендотелія судин, мононуклеарів людини і епітелії шлунка вошей людини. В штучних умовах добре розмножується в жовтковому мішку і в культурі фібробластів курячих ембріонів, викликає гарячку у морських свинок при внутрішньочеревному зараженні. У пацієнтів, які хворіли на висипний тиф, бувають рецидиви, які називаються хворобою Брілля. Рецидиви можуть виникати через десятки років після основного захворювання. В мікробіологічній практиці для діагностики застосовують серологічні реакції: Вейля-Фелікса (діагностичний титр 1:200 і вище), аглютинації з рикетсіями (діагностичний титр 1:100 і вище), непрямої аглютинації (діагностичний титр 1:160 і вище), РІФ, РЗК (діагностичний титр 1:80 і вище). Найбільш специфічні результати дає РЗК. Крім діагностичних титрів також треба орієнтуватись на збільшення титру антитіл.
Ку-гарячка	Ку-гарячка – гостре інфекційне захворювання людини і тварин, що викликається Coxiella burnetti, яка відноситься до родини Rickettsiaceae. Людина заражається від великої і дрібної рогатої худоби, сумчастих крис та інших тварин повітряно-крапельним і аліментарним (частіше через молоко) шляхами. Серед тварин інфекція передається іксодовими кліщами. Для зараження людини цей шлях не характерний.
Вейля-Фелікса реакція	Вейля-Фелікса реакція – це РА з сироватками хворих на висипний тиф. Діагности кумом в цій реакції є ОХ-19 Proteus vulgaris, який має загальні зі збудниками висипного тифу антигени. Діагностичний титр 1:200 і вище. Застосовують для серодіагностики висипного тифу, але чутливість і специфічність Вейля-Фелікса реакції нижча РА з рикетсіями.
Mycoplasma	Mycoplasma – рід дрібних аспорогенних грамнегативних аеробних або анаеробних мікроорганізмів з родини Mycoplasmataceae, які не мають ригідної клітинної стінки. Поліморфні: зустрічаються сферичні, еліпсовидної форми, розмірами 150-350 нм, а також ниткоподібні форми, довжиною в декілька мкм. Розмножуються на складних середовищах, температура культивування - 37°С. Для розмноження мають потребу в стеролах, а також в інших ростових факторах. На твердих середовищах утворюють дрібні (від 10 до 500 мкм в діаметрі) круглі з витягнутим в центрі колонії. В клітинних
	культурах розмножуються на поверхні клітин. Стійкі до пеніциліну, цефалоспоринам, але чутливі до тетрациклінів і еритроміцину. Паразитують на слизових оболонках сечостатевого і респіраторного шляхів. Мікоплазмові інфекції – захворювання людини, які викликають M.pneumoniae, M.hominis та інші. M.pneumoniae обумовлює гостру небактеріальну інтерстиціальну і перибронхіальну пневмонію і бронхіоліт. Діагностика складається з виділення та виявлення збільшення титру антитіл в РЗК, РИФ, РПГА та реакції імунної інгібіції мікоплазм. Збудника на ранніх стадіях хвороби можна виділити з глотки і промивних вод бронхів. Ріст на середовищах виявляють на 5-6 день після посіву матеріалу. Культуру ідентифікують за морфологією, характером росту на поживних середовищах і за допомогою серологічних тестів. M.hominis – викликає гострі ангіни і респіраторні захворювання, зазвичай без підвищення температури; простатити, уретрити. M.(Ureaplasma) urealyticum (колишня назва – Т-штами) виділяється при простатитах і негонорейних уретритах. Утворює дуже дрібні колонії (біля 40 мкм), потребує для росту додавання сечі, гідролізує сечовину.
Хламідії	Хламідії – це дрібні бактеріоподібні нерухомі аспорогенні безкапсульні грамнегативні облігатно-внутрішньоклітинні паразити ссавців і птахів з класу рикетсій. Описані одна родина і один рід, який включає 2 види: Ch.trachomatis – збудник трахоми, кон’юнктивіту з включеннями і венеричної гранульоми і Ch.psittaci – збудник пситакозу і орнітозу. У циклі розвитку можна виділити не меньше як 2 стадії існування хламідій, які відрізняються одна від іншої морфологією, властивостями, функціями: Стадія елементарного тільця – має овоїдну форму, розмірами 0,3х0,5 мкм, клітинна стінка у неї товста, ригідна, нуклеоід компактний, цитоплазма містить багато рибосом. Метаболізм різко знижений – це стадія спокою, призначена для переходу від одного хазяїна до іншого; елементарні тільця мають інфекційні властивості. В клітини хазяїна проникають шляхом фагоцитозу. В фагосомах інфікованих клітин елементарне тільце переходить в вегетативну стадію (репродуктивну), яка має назву “Ініціальне тільце”. Воно характеризується сферичною формою, діаметром 1,5-1 мкм, тонкою оболонкою, має фібрили нуклеоіду і рибосомальні елементи. Спочатку ініціальне тільце росте, потім ділиться на дочірні клітини, які знову діляться. Особини
	кінцевого поділу перетворюються в елементарні тільця, які розташовуються в цитоплазмі у вигляді мікроколоній, оточених загальною мембраною (хламидою). Інфікована клітина на цьому етапі гине, руйнується, елементарні тільця виходять назовні і фагоцитуються новими клітинами. Обидві форми грамнегативні. За Романовським-Гімза елементарні тільця фарбуються в червоний колір, ініціальні – в голубий. Метаболізм хламідій схожий з метаболізмом бактерій за виключенням того, що хламідії не здатні утворювати макроергічні сполуки (АТФ, НАДФ), це робить їх енергетично залежними від господаря. Всі хламідії добре ростуть на курячих ембріонах, особливо в жовточному мішку, деякі штами – в культурі клітин. Хламідії чутливі до дезінфектантів, особливо до формаліну, фенолу, а також до тетрациклінів, еритроміцину, левоміцетину. До сульфамідів чутлива Ch.trachomatis, але стійка Ch.psittaci. Викликає у хазяїна гострі і хронічні, клінічні та безсимптомні інфекції.
Трахома	Трахома – гострий або хронічний кератокон’юнктивіт людини, викликаний хламідіями, який закінчується утворенням рубців і нерідко сліпотою. Збудник – Сh.trachomatis має таку ж морфологію і онтогенез, як і інші хламідії.

4.2. Теоретичні питання до заняття.

· Таксономічне положення і основні біологічні властивості рикетсій, мікоплазм і хламідій, що зближує їх з бактеріями і вірусами.

· Методи культивування рикетсій, хламідій, мікоплазм.

· Роль рикетсій в патології людини. Патогенез і імуногенез при висипному тифі. Хвороба Брілля. Особливості патогенезу Ку-гарячки. Профілактика і лікування.

· Методи лабораторної діагностики висипного тифу та Ку-гарячки. Їх оцінка. Серологічна діагностика рикетсіозів.

· Класифікація хламідій, хвороби, які вони викликають. Патогенез, імунітет і особливості лабораторної діагностики хламідіозів.

· Мікоплазма- і уреаплазма-інфекції. Характеристика збудників. Патогенез, діагностика і лікування цих інфекцій.

4.3. Практичні завдання, які виконуються на занятті.

· Визначити таксономічне положення і основні біологічні властивості рикетсій, хламідій і мікоплазм. Ознайомитись з епідеміологією і патогенезом захворювань, які вони викликають.

· Засвоїти методи лабораторної діагностики рикетсіозів, хламідіозів та мікоплазмозів.

· Вивчити морфологічні і тинкторіальні властивості рикетсій і хламідій в демонстраційних препаратах, забарвлених за методом Здродовського та Романовського-Гімзи.

· Засвоїти методи серологічної діагностики висипного тифу та Ку-гарячки. Здійснити облік РЗК, РАР та РНГА, поставлених з метою серологічної діагностики рикетсіозів.

· Ознайомитись з препаратами для діагностики, специфічної профілактики та лікування рикетсіозів.

5. Зміст теми:

На практичному занятті студенти вивчають класифікацію і біологічні властивості рикетсій, хламідій і мікоплазм, знайомляться з патогенезом і імуногенезом захворювань, які ці мікроорганізми викликають; вивчають під мікроскопом препарати рикетсій, зафарбовані за методом Здробовського, вчаться на препаратах, отриманих від хворого на урогенітальний хламідіоз, виявляти включення хламідій в клітинах циліндричного епітелію уретри. Студенти аналізують методи лабораторної діагностики рикетсіозів, хламідіозів і мікоплазмозів, здійснюють облік реакції аглютинації рикетсій (РАР), зв’язування комплементу (РЗК), непрямої гемаглютинації (РНГА), поставлених з метою серодіагностики рикетсіозів, знайомляться з препаратами, які використовуються для діагностики, специфічної профілактики і лікування рикетсіозів.

Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.

5.1. Рекомендації для оформлення протоколу.

Методи лабораторної діагностики хламідіозів.

Патологічний матеріал: зскрібки зі слизових оболонок уретри, кон’юнктиви, центрифугат сечі, біоптат тканини, гній та інше.

1. Мікроскопічний метод. Використовується в практичних лабораторіях при діагностиці трахоми, урогенітального хламідіозу. Досліджуються мазки-зскребки з уретри, кон’юнктиви тощо, зафарбовані за методом Романовського-Гімзи. Виявлення 5-10 типових включень ретикулярних або елементарних тілець в цитоплазмі уражених клітин має діагностичне значення.

2. Експрес-метод. Виявлення морфологічних структур та антигенів у досліджуваному матеріалі за допомогою прямої і непрямої РІФ, ІФА з використанням моноклональних хламідійних антитіл. Чутливість ІФА по виявленню хламідій коливається в межах 50-70% у чоловіків і 88-100% у жінок.

3. Методи виділення і ідентифікації хламідій. Виділяють хламідії шляхом зараження курячих ембріонів або культури клітин (L-929, McCoy, HeLa). Це найбільш точний і доказовий метод діагностики хламідіозу (золотий стандарт). Через 48-96 годин інфіковані клітини забарвлюють за методом Романовського-Гімзи, або обробляють флуоресцентними антитілами і виявляють наявність цитоплазматичних включень. Метод високо специфічний (100%), чутливий (75%), результат відомий через 42-96 годин, але малодоступний для практичних лабораторій і є великий ризик зараження персоналу.

4. Серологічна діагностика. Використовують РНГА, непряму РІФ (в основному для діагностики зооноз них хламідіозів), РЗК (не використовується для діагностики урогенітального хламідіозу), ІФА (високо специфічний і доступний, використовують діагностичні тест-системи). Досліджують парні сироватки, визначають наростання титрів антитіл в 4 і більше разів.

5. Алергічна проба з орнітином (інактивована алантоїсна культура C.psittaci) ставиться як для ранньої (2-9 день захворювання), так і ретроспективної діагностики хламідійного орнітозу.

6. Біологічний метод діагностики. Тільки при хламідійному орнітозі, заражають інтрацеребрально, інтраназально або в черевну порожнину білих мишей-сосунків. В мазках-відбитках виявляють включення хламідій в цитоплазмі мононуклеарних клітин.

Мікробіологічна діагностика мікоплазма- і уреаплазма-інфекцій.

Патологічний матеріал: кров, харкотиння, слиз носоглотки, виділення і зскрібки з уретри, вагіни, шийки матки, осад сечі, сперма та інше.

Мікоплазмози.

1. Бактеріологічний метод. Найбільш доказовий. Проводять посів на щільні і двофазові середовища, виділення та ідентифікацію чистих культур. Для посіву використовують серцево-мозковий агар, двофазове середовище (селективний агар з налитим поверх нього сироватково-глюкозним бульйоном з додаванням пеніциліну і ацетату талія). Ознаки росту з’являються від одного до 7 тижнів. Прискорює цей метод ідентифікація колоній за допомогою епіфлуоресценції. Культури ідентифікуються на основі морфологічних, культуральних, ферментативних властивостей.

2. Експрес-метод. За допомогою РІФ, РНГА, ІФА, агрегат-аглютинації виявляють мікоплазми або їх антигени в клінічному матеріалі.

3. Серологічна діагностика. Застосовуються РЗК, ІФА, агрегат-аглютинація, непряма РІФ для виявлення специфічних антитіл в крові хворого.

Респіраторні мікоплазмози в практичних лабораторіях найчастіше визначають методами серодіагностики.

4. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – є найчутливішим методом діагностики мікоплазмозів.

Діагностика уреаплазмозів.

1. Бактеріологічний метод – найчастіше використовується на практиці.

Проводять посів на рідкі і щільні середовища. Облік результатів посіву через 24-48 годин за зміною кольору середовища при відсутності каламуті, що пов’язано зі здатністю U.urealiticum розщеплювати сечовину. Метод визначення уреазної активності є основним при діагностиці уреаплазмозів.

2. Експрес-метод. Мікроскопічне виявлення уреаплазм в препаратах сперми при забарвленні флуорохромом олівоміцином.

3. Серологічна діагностика в РЗК, непрямій РІФ, РНГА, ІФА, агрегат-аглютинації, але реактиви для цих реакцій малодоступні для практичних лабораторій.

Лабораторна діагностика рикетсіозів.

Патологічний матеріал: кров (джерело збудників), при Ку-гарячці – харкотиння, сеча, спинно-мозкова рідина, молоко, м’ясо тварин.

1. Мікроскопічний метод. Виявлення рикетсій в досліджуваному матеріалі, в організмі заражених тварин, курячих ембріонах. В тілі вошей, бліх, кліщів. Препарати зафарбовуються за Здродовським, Романовського-Гімзи.

Виділення збудника.

2. Методи культивування. Рикетсії не розмножуються в безклітинних середовищах, вони є облігатними внутрішньоклітинними паразитами. Культивуються на курячих ембріонах, фібробластах курячих ембріонів, на деяких культурах клітин (McCoy).

3. Біологічна діагностика. Для діагностики епідемічного висипного тифу (виділення R.prowazekii) біопроба малоефективна. Зараження тварин має діагностичне значення при Ку-гарячці, ендемічному висипному тифі (кров’ю хворого інфікують гвінейських свинок), при гарячці цуцугімуші (інфікують білих мишей, рідше хом’яків, бавовняних щурів). Але всілякі маніпуляції з рикетсіями дуже небезпечні (становлять великий ризик), тому виділення збудника проводять лише при наукових дослідженнях в спеціальних режимних лабораторіях.

4. Серологічна діагностика – основа сучасної лабораторної діагностики. Застосовують реакцію Вейля-Фелікса, аглютинації з рикетсіями, РНГА, РЗК, непряму РІФ (дозволяє ідентифікувати IgM і IgG, що дає можливість ранньої діагностики і визначення стадії хвороби).

Надійні результати можливі лише в кінці першого тижня захворювання. Крім визначення діагностичних титрів, необхідно також орієнтуватись на наростання титрів антитіл, що має більше епідемічне значення.

5. Полімеразна ланцюгова реакція розроблена для діагностики активних форм ерліхіозів.

Відобразити (переписати в протокол) таблицю:

Класифікація хламідій

Порядок Chlamydiales

Родина Chlamydiacea

Рід Chlamydia

Chlamydia trachomatis Chlamydia psittaci Chlamydia pneumoniae

Таблиця №1.

Збудники хламідіозів

Види	Захворювання	Серовари
Chlamydia trachomatis	Трахома і паратрахома	A, B, Ba, C
Урогенітальний хламідіоз і пневмонія новонароджених	D, F, G, H, I, J, K
Венерична гранульома	L1, L2, L3
Chlamydia psittaci	Орнітози (первинні патогени тварин)	13 (?)
Chlamydia pneumoniae	Пневмонія, ГРЗ, атеросклероз, саркоідоз, бронхіальна астма	TWAR, AR, KA, CWL

Класифікація мікоплазм

Клас Mollicutes

(mollis-м’який, cutes-шкіра)

Порядок Mycoplasmatales

Родина Родина Родина

Mycoplasmataceae Acholeplasmataceae Spariplasmataceae

Рід Mycoplasma рід Ureaplasma рід Acholeplasma рід Spairoplasma

Таблиця №2.

Збудники основних мікоплазмозів у людини

Вид мікоплазм	Захворювання
M.pneumoniae (агент Ітона)	Атипові пневмонії, фарингіти, ГРЗ
M.hominis, Ureaplasma urealyticum	Уретрити, цервіцити, простатити, вульвовагініти, пієлонефрити, патологія вагітності і плода, ін фертильність чоловіків.
M.hominis, M.fermentans, M.arthritidis	Артрити за типом ревматоїдного

Таблиця №3.

Основні біохімічні властивості мікоплазм, патогенних для людини

Вид	Гідроліз аргініну	Утворення кислоти при ферментації глюкози	Утворення кислоти при ферментації манози	Відновлення солей тетразолію (а.у.*/ан.у.*)
M.pneumoniae	-	+	+	+/+
M.hominis	+	-	-	-/-
M.fermentans	+	+	-	-/+
M.genitalium	-	+	±	+/-

* а.у. – аеробні умови; ан.у. – анаеробні умови.

Класифікація патогенних для людини ріккетсій

Порядок Rickettsiales

Родина Rickettsiaceae

Триба Rickettsiaea

Роди Rickettsia Orientia Erlichia Coxiella Bartonella

(Rochalimaea)

Група R.prowazekii O.tsutsugamushi E.sennetsu С.brunetti B.quintana

висипного R.Mooseri (Японія, лім- B.henselae

тифу фоїдна гіпер-

плазія)

Група R.rickettsii E.chaffensis

плямистої R.conorii (Північна Америка,

гарячки R.australis Європа, Азія;

Скелястих R.sibirica ери васкуліти,

гір R.acari гранульоми)

Завдання 1. Визначити морфологічні властивості рикетсій і хламідій в демонстраційних препаратах.

1. Препарат рикетсій 2. Включення хламідій в клітинах

(за Здродовським) циліндричного епітелію уретри

хворого на хламідіоз

(заб. за Романовським-Гімзи)

Завдання 2. Здійснити облік реакції аглютинації рикетсій (РАР), поставленої з метою серологічної діагностики рикетсіозів.

Завдання 3. Здійснити облік реакції зв’язування комплементу (РЗК), поставленої з метою серологічної діагностики висипного тифу.

Завдання 4. Здійснити облік реакції непрямої гемаглютинації (РНГА), поставленої з метою серологічної діагностики висипного тифу.

Завдання 5. Вивчити зразки препаратів, які використовують для діагностики, специфічної профілактики і лікування рикетсіозів.

Питання для самоконтролю.

· Таксономічне положення і основні біологічні властивості рикетсій, хламідій і мікоплазм. Чим відрізняються і що зближує ці мікроорганізми з бактеріями і вірусами?

· Класифікація рикетсій. Історія відкриття. Культивування рикетсій.

· Роль рикетсій в патології людини. Патогенез і імуногенез висипного тифу, хвороби Брілля. Особливості патогенезу Ку-гарячки.

· Методи лабораторної діагностики висипного тифу та Ку-гарячки, їх оцінка. Серологічна діагностика рикетсіозів.

· Які препарати використовуються для діагностики, лікування і специфічної профілактики висипного тифу і Ку-гарячки?

· Які хвороби викликаються хламідіями? Класифікація і біологічні властивості хламідій. Патогенез, імунітет, особливості лабораторної діагностики хламідіозів.

· Які є мікоплазма- і уреаплазма-інфекції? Характеристика збудників, патогенез, діагностика, лікування цих інфекцій.