Практичне заняття №10. Тема: «Збудники анаеробних інфекцій

Тема: «Збудники анаеробних інфекцій. Мікробіологічна діагностика анаеробних інфекцій».

1. Актуальність теми:

Патогенні споротворні анаероби належать до родини Clostridiaceae, роду Clostridium. До них входять збудники правця, ботулізму, анаеробної інфекції ран. Це крупні поліморфні грампозитивні бактерії; деякі види рухливі (перитрихи), у зовнішньому середовищі утворюють сферичні або овальні спори, розташовані термінально (паличка правця) або субтермінально (збудники анаеробної газової інфекції); за величиною спори іноді набагато перевищують товщину клітини; хемоорганотрофи. Більшість штамів ростуть в анаеробних умовах і мають різну ферментативну активність. Патогенні види анаеробів продукують екзотоксин, вони постійно живуть у кишках тварин і людини, з випорожненнями яких виділяються у зовнішнє середовище; у вигляді спор довго (роками) зберігаються в ґрунті, морській і прісній воді.

2. Конкретні цілі:

· Вивчити морфологічні та тинкторіальні властивості основних представників патогенних клостридій.

· Вивчити біологічні властивості збудників правця, ботулізму, анаеробної ранової інфекції.

· Створити схему мікробілогічної діагностики анаеробної ранової інфекції, правця, ботулізму.

· Здійснити окремі етапи мікробіологічної діагностики ранової інфекції (мікроскопію досліджуваного матеріалу, культивування та прискорену ідентифікацію клостридій - збудників анаеробної інфекції ран).

· Вивчити препарати для діагностики, специфічної профілактики та терапії клостридіозів.

3. Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція). Дивись практичне заняття №1.

4. Завдання для самостійної роботи під час підготовки до заняття.

4.1. Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:

Термін	Визначення
Облігатні анаероби	Облігатні анаероби – це бактерії, для яких наявність молекулярного кисню шкідлива.
Факультативні анаероби	Факультативні анаероби – це бактерії, які можуть розмножуватись як при наявності, так і при відсутності молекулярного кисню.
Мікроаерофіли	Мікроаерофіли – це бактерії, які розмножуються при низьких концентраціях кисню; висока концентрація кисню хоч і не вбиває бактерій, але затримує їх ріст.
Правець (столбняк)	Правець – гостра ранова інфекція людей і тварин, що розвивається в результаті уражень токсином нейромоторних клітин спинного і головного мозку, проявляється розвитком тонічних і тетанічних скорочень м’язів.
Ботулізм	Ботулізм – тяжка, часто фатальна токсикоінфекція, яка виникає внаслідок вживання продуктів, що містять токсини Clostridium botulinum, супроводжується специфічними ураженнями нервової системи, переважно ядер язико-гортанних і окуломоторних нервів.
Анаеробна газова інфекція (клостридіальний міозит, газова гангрена)	Анаеробна газова інфекція – гостра, тяжка, полі- етіологічна ранова інфекція, яку викликають бактерії роду Clostridium в асоціації між собою і умовно-патогенними мікроорганізмами.
Середовища для культивування анаеробних мікроорганізмів	Середовище Кітта-Тароцці, кров’яний цукровий агар Цейслера, середовище Вільсон-Блера, середовище Врублевського.

4.2. Теоретичні питання до заняття:

· Загальна характеристика бактерій роду клостридій.

· Біологічні властивості збудників правця, ботулізму та анаеробної інфекції ран.

· Особливості патогенезу правця, ботулізму та анаеробної інфекції ран.

· Принципи мікробіологічної діагностики клостридіозів; матеріал, який необхідно досліджувати при даних захворюваннях.

· Імунітет при клостридіозах, принципи специфічної терапії та профілактики при даних захворюваннях. Препарати.

· Клостридії – збудники харчових токсикоінфекцій.

4.3. Практичні завдання, які виконуються на занятті:

· Вивчити морфологічні та тинкторіальні властивості основних представників патогенних клостридій.

· Створити схему мікробілогічної діагностики ботулізму, правця,

· Розпочати прискорену діагностику анаеробної ранової інфекції.

· Вивчити препарати для діагностики, специфічної профілактики та терапії клостридіозів.

5. Зміст теми:

На практичному занятті студенти вивчають загальну характеристику бактерій роду клостридій, морфологічні та тинкторіальні властивості основних представників патогенних клостридій; розглядають біологічні властивості збудників правця, ботулізму та анаеробної інфекції ран та особливості патогенезу захворювань, що ними викликаються; створюють схему мікробілогічної діагностики анаеробної інфекції; розпочинають прискорену діагностику анаеробної ранової інфекції; вивчають препарати для діагностики, специфічної профілактики та терапії клостридіозів.

Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.

Виділення чистої культури анаеробів.

Матеріал (раневое содержимое, кусочки тканей) ↓
I	II	III	IV
Посев 1) Мікроанаеро- стат; 2) Ролерне культивування; 3) Рукавичковий бокс; 4) Ізоляція   →	Морфологія колонії (Фарбування за Грамом)   →	Ідентифікація 1) Ферментація вуглеводів; 2) Біохімічні тести; 3) Газова хроматографія продуктів метаболізму →	Чутливість до антибіотиків

Рекомендації для оформлення протоколу.

Основні анаеробні мікроби, важливі для медичной микробиологии.

Спороутворюючі:

Грампозитивні бактерії

- Clostridium (біля 100 видів)

Неспороутворюючі:

Грам позитивні бактерії Грамнегативні бактерії і спіральні форми

- Actinomyces - Anaerovibrio - Prevatella

- Bifidobacterium - Anaerobospirillum - Campilobacter

- Lactobacillus - Bacteroides (> 40 видів) - Leptotrichia

- Propoinobacterium - Fusobacterium - Porhpyromonas

- Treponema - Borellia

Грам позитивні коки Грамнегативні кокі

- Peptococcus - Veilonella

- Peptostreptococcus

- Sarcina

Характеристика збудників анаеробних інфекцій

Збудник	Морфологія	Розташуван-ня спори	Рух ли вість	Кап- сула	Форма колоній на кров'яному агарі	Ферментація
Глюкоза	Лак тоза	Саха роза	Разжіже-ння згорнутої сироватки	Зміни молока
Cl. perfringens	Товста з обрубленими (заокругленими) кінцями паличка	Центральне або субтер-мінальне	-	+	Круглі, гладкі із зеленуватим гемолізом	+	+	+	-	Швидке згортання. Газоутворення
Cl. novii	Товста із закругленими кінцями	Субтермі-нальне	+	-	Шорсткі гемолітичні	+	-	-	-	Повільне згортання. Газоутворення
Cl. septicum	Поліморфна тонка паличка	Субтермі-нальне або центральне	+	-	Ніжне мереживне зростання, гемоліз.	+	+	-	-	Повільне згортання
Cl. histolyticum	Тонка із заокругленими кінцями паличка	Субтермі-нальне	+	-	Дрібні гладкі «росинки» без гемолізу	-	-	-	+	Пептонізація
Cl. tetani	Тонка паличка 4-8 мм	Терміналь-не	+	-	Ніжне мереживне зростання дрібними пучками; гладкі прозорі колонії «росинки» з гемолізом	-	-	-	-	Слабке згортання
Cl. botuli- num	Поліморфна (із заокруг-леними кінцями) паличка	Субтермі-нальне або термінальне	+	-	Шорсткі сірі опуклі в центрі з ізрізанними краями. Відростки коло-ній двуконтур-ні. Гемоліз.	+	-	-	-	Повна пепто-низація

Хід досліджень при виявленні збудника ботулізму.

1 день дослідження	2 день дослідження	3 день дослідження
Матеріал хворого: - промивні води (розтирають); - блювотні маси (розтирають); - кров (розводять цитратом Na 1:3) ↓ приготування мазків з дослідного матеріалу - забарвлення по Граму; - виявлення капсул методом Йоне ↓ I. Посів на Кітта-Тароцці; стерильне лакмусове молоко; середовище Вільсона-Блера; середовище Врублевського; жовткове середовище, 5% кров'яний МПА і культивування в умовах анаеростата.   II. Виявлення ботулінічного токсину. Матеріал хворого екстрагують в 0,9% р-ні Nacl, фільтрують, центрифугують. Підготовлений матеріал розливають по 1 мл в 5 пробірок.   A B E F нормальна   В пробірки додають по 1 мл протиботулінічних сироваток різних сероваріантів. ↓ Проводять зараження п'яти лабораторних тварин (білих мишей). Вводять по 0,5-1,0 мл кожної суміші внутрішньочеревно або підшкірно.	I. Облік і опис результатів росту мікроорганізмів на рідких і щільних живильних середовищах: - середовище Кітта-Тароцці, стерильне лакмусове молоко; середовище Вільсона-Блера; середовище Врублевського; жовткове середовище; анаеробний кров'яний агар. ↓ приготування мазків з колоній, що виросли, забарвлення по Граму. ↓ Виявлення типових “тенісних ракеток” із спорами. ↓ Висів чистої культури на середовище Врублевського	I. Вивчення росту мікроорганізмів на середовищі Врублевського.   ↓ Забарвлення колоній по методу Грама. ↓   Ідентифікація збудника: - По морфології (рухливість); - у РНГА; - визначення біохімічної активності (розкладання глюкози; гідроліз желатину; ферментація ліпази; пептонізація молока); - по антигенній структурі в РА на склі.   II. Облік виявлення ботулінічного токсину. Якщо в дослідному матеріалі був ботулінічний токсин, виживе лише тварина, якій ввели токсин, нейтралізований відповідною сироваткою. У останніх тварин розвивається парез кінцівок, ураження внутрішніх органів.

Хід дослідження для виявлення збудника правця.

1 день дослідження	2-3 день дослідження	4-5 день дослідження
Матеріал хворого: - раньове відокремлюване; - шматочки тканин ↓ приготування мазків з дослідного матеріалу ↓ - забарвлення по Граму; - виявлення спор методом Циля-Нільсена ↓   I. Посів на середовище Кітта-Тароцці, 5% кров'яний МПА і культивування в умовах анаеростату.   II. Матеріал хворого екстрагують в 9% розчині NaCl. З метою ідентифікації токсину вводять екстрагований матеріал експериментальним тваринам (білим мишам).	I. Облік і опис результатів росту мікроорганізмів на живильних середовищах: - характеристика колоній; - приготування мазків з тих, колоній, що виросли та забарвлення по Граму ↓ висів чистої культури на середовище Врублевського     II. Облік ідентифікації токсину на лаборатоних тваринах. У експери- менті розвивається клінічна картина правця.   III. Постановка реакції нейтралізації. Культуру, вирощену на середовищі Кітта-Тароцці центрифугують. Надосадову рідину змішують з антитоксичною протиправцевою сироваткою (і з NaCl 9% для позитивного контролю). Вводять двом білим мишам внутріш-ньом'язево біля кореня хвоста.	I. Вивчення зростання мікроорганізмів на середовищі Врублевського     ↓ забарвлення колоній по методу Грама.   III. Облік реакції нейтралізації. У першої тварини в результаті нейтралізації токсину антитоксином візуальні прояви відсутні. У другого – розвивається регідність хвоста і м'язів в місці введення токсину, тварина гине.

Хід дослідження для виявлення збудника газової гангрени.

1 день дослідження↓	2-3 день дослідження	4-5 день дослідження
Матеріал хворого: - ексудат; - відокремлюване гнійних ран; - шматочки некротизо- ваних тканин ↓ I. Приготування мазків з досліджуваного матеріалу → забарвлення по Граму; → виявлення капсул методом Йоне   а) посів на стерильне лакмусове молоко; середовище Вільсона-блера; середовище Врублевського б) висів на середовище Кітта-Тароцці жовткове середовище, 5% кров'яний МПА і культивування в умовах анаеростата. II. Постановка реакції нейтралізації з екзотоксином: Для постановки реакції беруть ряд пробірок, в кожну вносять по 0,9 мл вирощеної культури і 0,6 мл відомих полівалентних або моновалентних антитоксичних сироваток (C.perfringens; C.novyi A і B; C. septicum; C.bifermentans). Суміш в кількості 0,5 мл вводять внутрішньочеревно лабораторним тваринам (білим мишам).	I. Облік і опис результатів росту мікроорганізмів на рідких і щільних живильних середовищах: - стерильне лакмусове молоко; середовище Вільсона-Блера; середовище Врублевського; - Середовище Кітта-Тароцці; жовткове середовище; анаеробний кров'яний агар. ↓ приготування мазків з колоній, що виросли, забарвлення по Граму   ↓ висів чистої культури на середовище Врублевського	I. Вивчення росту мікроорганізмів на середовищі Врублевського     ↓ забарвлення колоній по методу Грама.   II. Облік реакції нейтралізації. У разі нейтралізації токсину антитоксином тварина виживає (позитивний результат); у разі невідповідності сироватки і типу токсину – гине.

Демонстраційні препарати для специфічної профілактики, діагностики та терапії клостридіозів:

o АКДП;

o Правцевий анатоксин;

o Протиправцева сироватка;

o Протиботуліністичні сироватки;

o Протигангренозні сироватки.

Робота №1. Ознайомитися з морфологічними і тинкториальными

властивостями клостридій (демонстрація; зробити малюнок).

Clostridium tetani Clostridium botulinum Clostridium perfringens

Фарбування по Граму.

Зробити висновок.

Робота №2. Вивчити прискорену діагностику анаеробної раньової інфекції.

Матеріал для дослідження: → середовище Врублевського

посів

→ стерильне лакмусове молоко

→ середовище Вільсона-Блера

Зробити висновок.

Питання для самоконтролю.

· Історія відкриття збудників анаеробних інфекцій.

· Класифікація анаеробів.

· Морфологічні та біологічні властивості збудників правцю, ботулізму, анаеробної інфекції ран.

· Патогенетичні та імунобіологічні особливості правцю, ботулізму та анаеробної раньової інфекції.

· Фактори патогенності збудників правцю, ботулізму та анаеробної раньової інфекції.

· Методи мікробіологічної діагностики анаеробної інфекції.

· Препарати для профілактики та лікування правцю, ботулізму, анаеробної інфекції ран.

7. Рекомендована література.

Основна:

1. П’яткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією. Київ. “Вища школа”. 1992, 431 с.

2. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология; М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2005, 734 с.

3. Климнюк С. І, Ситник І. О., Творко М. С., Широбоков В. П. – Практична мікробіологія.-Тернопіль, „Укрмедкнига”, 2004, 438 с.

4. Воробьёв А. А., Кривошеин Ю. С., Широбоков В. П. Медицинская и санитарная микробиология: учеб. пособие.— М., 2008. – 462 с.

5. Широбоков В.П., Янковський Д.С., Димент Г.С. Мікробна екологія людини з кольоровим атласом. Навчальний посібник.— К., 2009.-312 с.

6. Палій Г. К., Палій В. Г., Мруг В. М. Мікробіологія, вірусологія, імунологія, інфекційні хвороби. Словник / За ред. Г. К. Палія, В. Г. Палій.-Київ: Здоров’я, 2004. 196 с.

Додаткова:

1. Красильников А. П. Микробиологичексий словарь-справочник.— Минск, 1986.

2. Medical microbiology / edited by Samuel Baron, MD. – 4^th ed. The University of Texas Medical Branch and Galveston, 1996, 1273 p.

3. W.Levinson, E.Jawetz. Medical microbiology and immunology: examination and board review, 6^th ed. The McGraw-Hill Companies, 2000, 582 p.

4. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования; М., 1983.