Биопсия и гистопатология

Хотя вирусы могут быть изолированы из тканей рептилий и без сопутствующих гистологических процедур, гистологический анализ необходим для уточнения данных световой микроскопии, на основании которых ставится предварительный диагноз. Биопсию берут из кожи и внутренних органов, следуя обычной технике. Гистопрепараты, приготовленные из биоптатов, имеют ограниченное применение для диагностики вирусных инфекций. Включения легко обнаруживаются в срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, но плохо видны в тонких мазках, окрашенных различными модификациями краски Романовского. Биопсию делают, когда необходимо провести прижизненную диагностику вирусного заболевания. Например, при IBD у боид, биопсию обычно берут из пищеводных желез или слизистой желудка, используя гибкие эндоскопы, или из печени, используя лапараскоп или под контролем УЗИ. Идентификацию включений легче всего проводить в парафиновых срезах или замороженных препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином (Jacobson, 2000). Автор не использовал другие, может быть, более специфичные методы окраски. Материал можно использовать после предварительной обработки для световой или электронной микроскопии и нативный – для культивирования.

При подозрении на вирусную инфекцию необходимо проводить полное вскрытие всех павших рептилий. Ткани (сердце, легкие, печень и селезенка) отбираются в первую очередь, соблюдая правила асептики. Образцы тканей следует паковать в стерильные контейнеры индивидуально и замораживать, желательно при –70°С. В случае, если это невозможно, используют заморозку до –20°С. Некоторые вирусы (например, парамиксовирусы) можно выделить из тканей, сохранявшихся подобным образом в течение нескольких месяцев.

Многие клиницисты отбирают только 1-2 вида тканей от наиболее измененных органов. Важно, чтобы были собраны ткани всех основных систем органов. Образцы головного и спинного мозга всегда отбирают при вирусных инфекциях, сопровождающихся поражениями ЦНС, например IBD. Биоптаты и образцы, взятые во время вскрытия, фиксируют в 10%-м буферном формалине, а если предполагается проводить электронную микроскопию, дополнительные образцы материала помещают в раствор Трампа (4%-й формалин в смеси с 1%-м глутаровым альдегидом). Если предполагается использовать иммуногистохимию, как в случае парамиксовируса змей, ткани следует перенести и сохранять в 70%-м этаноле в течение 24-48 часов после первоначальной фиксации.

Замороженные ткани можно использовать для обнаружения вирусного антигена с помощью меченных антителами флуоресцентных красителей. Этот метод применяют для выявления вируса в тканях легких в случае парамиксовироза змей.

Основываясь на результатах световой микроскопии, таких как обнаружение внутриядерных или внутрицитоплазматических включений, препарат затем подготавливают к трансмиссивной электронной микроскопии (ТЭМ). Хотя для этого метода идеально применять препараты, фиксированные раствором Трампа или 2,5%-м глутаровым альдегидом, можно также использовать ткани, фиксированные формалином и даже залитые парафином. Парафиновые препараты нарезают на микротоме, фиксируют и подготавливают для ТЭМ. Важно, чтобы препарат содержал достаточное количество включений или других изменений, так как стандартный образец ткани содержит не более 100-500 клеток. В США стоимость одного исследования с использованием ТЭМ составляет от 100 до 200 долларов и включает в себя подготовку препарата, срезов, исследование и фотографирование. Исследование обычно позволяет определить систематическое положение вируса до ранга семейства, основываясь на размерах, локализации, морфологии и морфогенезе вирусов. Конечное заключение проводят, основываясь на биохимической характеристике или определении специфических нуклеотидных последовательностей ДНК с помощью ПЦР.