Методы исследования внутриклеточных цитоплазматических и ядерных белков - факторов транскрипции, сигнальных молекул и других

Методы твердофазных иммуноанализов типа ELISA используют и для изучения молекулярных процессов проведения сигналов от мембранных рецепторов внутрь клетки. Эксперименты такого типа состоят из двух этапов.

Творческий поисковый этап - создание модели активации определенных живых клеток in vivo или в культуре in vitro.

Технический этап:

а) лизис клеток без денатурации макромолекул;

б) детекция искомых молекул передачи сигналов методом ловушечного ИФА.

В качестве «ловушки» на твердой фазе используют высокоспецифичные антитела к определенным эпитопам, характерным для активированного состояния молекул, например сайтам фосфорилирования конкретных белков, участвующих в проведении сигнала. В этой связи коммерческие тест-системы такого назначения получили название «phosphoELISA».

Внутриклеточные белки исследуют в целях анализа конкретных молекулярных путей проведения сигналов в клетке (англ. pathways - путь), определяя конкретные киназы, фосфатазы, адаптерные белки, факторы транскрипции и др.

Для исследования внутриклеточных цитоплазматических белков и их производных интересующие клетки тщательно отмывают от внеклеточных субстанций 2-3-кратным центрифугированием (800 g, 5-6 мин) в фосфатном солевом буферном растворе, после чего лизируют буфером следующего состава (одного из возможных): 50 mM Tris, pH 7,4; 250 mM NaCl; 5 mM EDTA (этилендиаминтетраацетат); 1% NP40 (Nonidet P40); 50 mM NaF; 1mM Na₃VO₄; 1 mM PMSF (ингибитор сериновых протеаз - трипсина и химотрипсина - фенилметан-сульфонил флюорид, матричный 0,3 М раствор в ДМСО, добавляют ex temporo); смесь ингибиторов протеаз (AEBSF, пепстатин А, Е-64, бестатин, лейпептин, апротинин или других, добавляют ex temporo).

Осадок отмытых фосфатным буфером клеток ресуспендируют в лизирующем буфере и оставляют на 15 мин в условиях мягкого перемешивания. Затем лизат центрифугируют при 14 000 об/мин в течение 10 мин, разливают по аликвотам, определяют в нем общую концентрацию белков (чаще всего - методом Bradford). Наиболее приемлемы для дальнейших анализов концентрации белков 200- 400 мкг/мл.

В дальнейшем выполняют обычный ловушечный вариант ELISA (см. выше). Весьма важен как можно более многосторонний контроль (как минимум заведомо положительный контроль, заведомо отрицательный контроль, а также лизат одноименных, но неактивированных клеток, лизат клеток, обработанных «посторонним» биохимически родственным активатору веществом и др.).