Нестерильные условия работы

1. Лунки тщательно промывают сначала водой с целью удаления клеток, затем отмывочным буфером с детергентом (0,1% Tween-20), чтобы смыть все, что плохо связалось.

2. В лунки вносят конъюгат проявляющего антитела-2 с биотином, инкубируют 2 ч.

3. Промывают и вносят конъюгат «авидин-пероксидаза», инкубируют 1 ч.

4. Промывают и вносят субстратную смесь - АЕС [3-амино-9- этилкарбазол, растворенный исходно в N,N-диметилформамиде (100 мг АЕС на 10 мл DMF) и разбавленный до конечной концентрации в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5 и плюс перекись водорода; рецепт

субстратной смеси: 333,3 мкл матричного раствора АЕС + 10 мл ацетатного буфера + 5 мкл 30% перекиси водорода].

5. Реакцию останавливают под визуальным контролем через 5-50 мин путем промывки плэйтов водой.

6. Плэйты сушат при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч.

7. Регистрируют результат, т.е. подсчитывают пятна: либо «вручную», под соответствующим микроскопом (результаты получают в «двоичной системе» - «много» или «мало»), либо в специальном аппарате, считывающем картину дна лунок видеокамерой и соответствующей компьютерной программой анализа пятен (получают цифровой результат).

Результаты, получаемые в ELISPOT, отражены на рис. 4.13 (см. также цв. вклейку).

Рис. 4.13. Примеры результатов ELISPOT: увеличенное изображение двух лунок: лунки с положительным результатом (а), с четко различимыми «пятнами», подлежащими подсчету; лунки с отрицательным результатом (б)